Två metoder för Decellularization av växt vävnader för Tissue Engineering program

Summary

Här presenterar vi och kontrast två protokoll används för att decellularize växt vävnader: en diskmedel-baserade strategi och en tvättmedel-gratis strategi. Båda metoderna lämna bakom den extracellular matrisen av växt vävnader används, som sedan kan utnyttjas som ställningar för tissue engineering program.

Abstract

Autolog, syntetiska och animaliska grafterna för närvarande används som ställningar för vävnad ersättare har begränsningar på grund av låg tillgänglighet, dålig biokompatibilitet och kostnad. Växt vävnader har goda egenskaper som gör dem unikt lämpad för använda som ställningar, såsom höga yta, utmärkt vattentransport och lagring, sammankopplade porositet, konstaterad vaskulär nätverk och ett brett utbud av mekaniska egenskaper. Två framgångsrika metoder för växt decellularization för tissue engineering program beskrivs här. Den första metoden bygger på tvättmedel bad för att ta bort cellulära material, som liknar tidigare etablerade metoder användas för att rensa däggdjur vävnader. Andra är en tvättmedel-fri metod anpassad från ett protokoll som isolerar leaf vaskulatur och innebär användning av en uppvärmd blekmedel och salt bad att rensa blad och stjälkar. Båda metoder ge ställningar med jämförbara mekaniska egenskaper och låg cellulära metaboliska effekt, vilket möjliggör för användaren att välja det protokollet som bättre passar deras avsedda tillämpning.

Introduction

Vävnadsteknik dök upp på 1980-talet att skapa levande vävnad substitut, och potentiellt adress betydande organ och vävnad brist¹. En strategi har använt ställningar för att stimulera och vägleda kroppen att regenerera saknas vävnader eller organ. Även om avancerad tillverkning metoder såsom 3D-utskrift har producerat ställningar med unika fysiska egenskaper, förblir förmågan att tillverka ställningar med ett varierat utbud av uppnåeliga fysiska och biologiska egenskaper en utmaning^{2 , 3}. Dessutom på grund av en funktionell vaskulär nätverk, dessa tekniker har begränsats i regenererande 3-dimensionell vävnader. Användning av cell-lösa djur och mänskliga vävnader som ställningar har hjälpt kringgå detta problem^4,5,6,7. Men höga kostnader, sats till sats variabilitet och begränsad tillgänglighet kan begränsa utbredd användning av cell-lösa djur ställningar⁸. Det finns också farhågor om potentiella sjukdomsspridning till patienter och immunologisk reaktion mot vissa cell-lösa däggdjur vävnader⁹.

Cellulosa, härrör från växt- och bakteriella källor, har använts i stor utsträckning att generera biomaterial för ett brett användningsområde inom regenerativ medicin. Några exempel är: Ben^10,11, brosk^12,13,14 och¹⁵för sårläkning. Ställningar som består av cellulosa har en fördel i att de är hållbara och motståndskraftiga mot att brytas ner av däggdjursceller. Detta är på grund av att däggdjursceller inte producerar enzymerna som är nödvändiga för att bryta ner cellulosa molekyler. I jämförelse, ställningar produceras med hjälp av makromolekyler från den extracellulära matrixen, såsom kollagen, bryts lätt ned¹⁶ och kanske inte passar till långsiktiga program. Kollagen ställningar kan stabiliseras av kemiska cross-linking. Det finns dock en avvägning på grund av den inneboende toxiciteten för de cross-linkers som påverkar biokompatibiliteten av ställningar¹⁷. Omvänt, cellulosa har potential att vara närvarande vid implanteringsstället för längre perioder eftersom det är okänsligt mot enzymatisk nedbrytning av däggdjursceller^18,19,20. Detta kan ändras genom att trimma nedbrytningshastighet genom hydrolys förbehandling och samtidig leverans av ställningar med cellulases²¹. Biokompatibiliteten av cell-lösa vegetabiliska cellulosa ställningar i vivo har också påvisats i en studie på möss²².

Genom hundratals miljoner år av evolution, har växter förfinat sin struktur och sammansättning för att öka effektiviteten i vätsketransport och lagring. Anläggningen vaskulär fartyg minimera hydrauliska motstånd genom förgrening till mindre fartyg, liknar den hos däggdjur vaskulatur enligt Murrays lag²³. Efter decellularization bibehålls växtens komplext nätverk av fartyg och sammankopplade porer. Med tanke på det stora antalet olika växtarter som är lättillgänglig har vegetabiliska ställningar potential att övervinna designbegränsningar som för närvarande påverkar ställningar i tissue engineering^24,25. Exempelvis visat Modulevsky et al. att angiogenes och cell migration inträffade när cell-lösa apple vävnad var implanteras subkutant på baksidan av en mus²². Likaså visade Gershlak et al. att endotelceller kunde odlas inom vaskulatur cell-lösa blad²⁴. I en separat experiment kunde Gershlak et al. också visa att hjärtmuskelcellerna kan odlas på ytan av blad och skulle kunna ingå avtal²⁴.

Växter även komplexa organisationen från cellnivå till makroskopiska skalan, vilket är svårt att uppnå även med de mest avancerade tillverkningstekniker som utvecklat hittills. Den komplexa hierarkiska utformningen av växt vävnader gör dem starkare än summan av deras beståndsdelar²⁶. Växter har en uppsjö av olika mekaniska egenskaper alltifrån styv och tuff komponenter såsom stjälkar, till mycket mer flexibel och smidig kära som lämnar²⁷. Bladen varierar beroende på Art storleksmässigt, forma, bryta styrka, graden av vaskularisering, och kan bära olika grader av hydrophilicitet. Sammantaget tyder dessa växt-egenskaper på att cell-lösa växter kan tjäna som unika och mycket funktionell medicintekniska produkter, inklusive som Vävnadsrekonstruktion ställningar.

Detta protokoll fokuserar på två metoder att decellularize växt vävnader, såsom blad och stjälkar, för användning som ställningar i vävnadsteknik. Den första metoden är ett diskmedel-baserade teknik som använder en rad bad att ta bort DNA och cellulära materia, som har anpassats från en allmänt använd teknik decellularize däggdjur och plantera vävnader^{6,22,25 ,28,29,30}. Den andra metoden är fritt från rengöringsmedel och är anpassade från en ”skeletonization”-protokollet används ofta för att ta bort de mjuka vävnaderna i blad³¹. Tidigare arbete visade att puttra bladen i en blekmedel och natriumbikarbonat lösning underlättat separation av kärlsystemet från omgivande mjukvävnad³¹. Denna teknik kan hänvisas tillbaka till experiment som utförts i den 17^{: e} och 18^{: e} århundraden, såsom Albertus Seba³² och Edward Parrish³³arbete. Dessa experiment centrerad kring lämnar växtmaterial, som löv och frukt, nedsänkt i vatten under längre tid (veckor till månader) och att låta mjukare vävnader att förfalla bort naturligt. Här är metoden ”skeletonization” anpassad för att använda mildare villkor, såsom längre inkubationstider vid lägre temperaturer, att ta bort cellulära rester och undvika påtagligt störa mjuk vävnad struktur. För de experiment som beskrivs häri, tre växttyper användes: Ficus hispida, Pachira aquatica och en art av Garcinia. Resultaten av DNA kvantifiering, mekaniska tester och inverkan på cellulära metaboliska aktiviteten från båda metoderna beskrivs.

Protocol

1. decellularization av växtvävnad använder metoden med diskmedel-baserade Använd färska eller frysta F. hispida, leaf prover. Frysa oanvända färska prover i en frys-20 ° C och store för framtida användning (upp till ett år).Obs: Använd stam eller blad vävnad av nästan varje önskad anläggning. Utökad lagring gånger kan skada vävnader. Bestämma storleken och formen av prover bearbetas utifrån provets avsedd användning (dvs. prover strimlat lä…

Representative Results

Båda metoderna gav ställningar som var lämpliga för cellodling och Vävnadsrekonstruktion applikationer. Figur 1 visar det allmänna arbetsflödet för decellularization processen med en intakt blad för diskmedel-baserade metod och skära prover (8 mm diameter) för metoden tvättmedel-fri. Lyckad decellularization av Ficus hispida vävnader efter båda metoderna gav tydlig och intakt prover (figur 1A och 1B…

Discussion

Häri, beskrivs två metoder för att decellularize växt vävnader. Resultaten presenteras här, tillsammans med resultaten av tidigare studier²⁵, tyder på att protokollen uträcka sannolikt gäller för ett brett spektrum av växtarter och kan utföras på både stjälkar och blad. Dessa förfaranden är enkel och kräver inte specialutrustning, så växten decellularization kan utföras i de flesta laboratorier. Det är anmärkningsvärt att ställningar måste vara functionalized efter decell…

Materials

Sodium dodecyl sulfate	Sigma Life Science	75746-1KG
Triton X-100	MP Biomedicals, LLC	807426	Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite)	Clorox	Item #: 31009	Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonate	Acros Organics	217120010	Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm Biopunch	HealthLink	15111-80	Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake table	Stovall Life Sciences	BDRAA115S	Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plate	Fisher Scientific		Can use any style/brand of hot/stir plate.
Beaker	Any		Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris Hydrochloride	Fisher Scientific	BP153-500
DMEM	Corning	MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay	Life Technologies	P11496	Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.