Summary
Il protocollo descritto qui utilizza un approccio di photolabeling in topi neonati per identificare in modo specifico le cellule immuni che emigrano dal colon in siti extra-intestinali. Questa strategia sarà utile per studiare le interazioni ospite-microbiome nella vita in anticipo.
Abstract
Comunità batteriche enteriche sono stabilite all'inizio della vita e influenzano la funzione e lo sviluppo delle cellule immuni. Il microbiota neonatale è suscettibile di numerose influenze esterne, tra cui l'uso di antibiotici e dieta, che urta la suscettibilità alle malattie autoimmuni ed infiammatorie. Disturbi come la malattia di viscere infiammatoria (IBD) sono caratterizzati da un massiccio afflusso di cellule immuni agli intestini. Tuttavia, le cellule immunitarie condizionate dal microbiota possono inoltre emigrare fuori gli intestini per influenzare le risposte immunitarie a siti extra-intestinali. Così, c'è una necessità di identificare e caratterizzare le cellule che possono trasportare messaggi microbici dall'intestino ai luoghi distali. Qui, descriviamo un metodo alle cellule di etichetta nel colon dei topi neonati in vivo che consenta la loro identificazione presso siti extra-intestinali dopo la migrazione.
Introduction
Il tratto gastrointestinale dei mammiferi ospita centinaia di specie di batteri presenti in un rapporto simbiotico con l'host1. Le cellule immunitarie presenti nell'ambiente locale applicare una coesistenza pacifica con questi microbi e stabilire una barriera protettiva contro le invasioni di agente patogeno. Così, bi-direzionale interazioni tra le cellule immunitarie e il microbiota sono fondamentali per stabilire una comunità commensale che educa il sistema immunitario dell'ospite e imposta la soglia per la reattività immune agli agenti patogeni. Cambiamenti nel microbiche composizione, o disbiosi, può disturbano l'omeostasi immunitaria e perturbano circuiti regolatori che trattengono infiammazioni intestinali che portano a malattie immuno-mediate come diabete di tipo 1 e IBD2,3 .
Il periodo immediatamente dopo la nascita è un'unica finestra inerente allo sviluppo durante il quale le comunità microbiche intestinali cominciano a stabilire allo stesso tempo il sistema immunitario matura4. Il microbiota postnatale non è stabile, con variazioni nella composizione della comunità che si verificano naturalmente e frequentemente5. Le cellule immunitarie che interagiscono con il microbiota risiedono in due distinte posizioni anatomiche nell'intestino - della propria di lamina e l' epitelio intestinale6. Numerosi tipi di cellule immunitarie sono presenti nell'intestino, compreso i linfociti (ad esempio cellule T, cellule B e cellule linfoidi innate) così come le cellule mieloidi (che includono macrofagi, monociti e cellule dendritiche). Queste cellule, anche conosciuto come cellule ematopoietiche, eseguono una moltitudine di funzioni che preservare la barriera intestinale e mantenere l'omeostasi.
Oltre alle loro funzioni di regolamentazione presso siti intestinali, le cellule immuni della mucosa possono anche portare messaggi microbici ai siti extra-intestinali per regolare l'immunità sistemica7,8,9. Questa è un'area di crescente interesse per la ricerca e sottolinea la necessità di metodi per identificare le cellule immunitarie che migrano dai tessuti intestinali al fine di sondare la loro funzione. Il protocollo segnalato qui utilizza un modello di topo commercialmente disponibili in cui viene sfruttata una proteina fluorescente fotoconvertibile alle cellule di etichetta. PhAMasportato topi ubiquistmente esprimono una proteina fluorescente verde di Dendra2 che è irreversibilmente passata a fluorescenza rossa al momento dell'attivazione di raggi ultravioletti (UV) luce10. Utilizzando una cannula di fibra ottica per consegnare 405 nm luce nel colon dei topi neonati, dimostriamo che le cellule ematopoietiche photoconverted, che hanno provenuto o transitato attraverso il colon possono essere trovate nella milza.
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Protocol
Tutte le procedure degli animali sono state effettuate con l'approvazione di e conforme ai istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) presso il Massachusetts General Hospital.
Attenzione: Questo protocollo prevede l'utilizzo di un laser di classe 3b (LG3). LG3 laser occhiali di sicurezza devono sempre essere utilizzati quando si opera questo laser. Opportune linee guida formazione e sicurezza devono essere seguite per evitare il rischio di lesioni.
1. progettazione e assemblaggio di Laser
- Collegare il diodo luminoso (LED) (405 nm, 19,3 mW, mA 1400, accoppiati in fibra) al LED driver tramite il cavo del connettore M8 a 4 pin che viene collegato al LED. Serrare la vite per fissare il raccordo.
- Prima di collegare il cavo di patch optogenetica al LED, tenere il connettore apertura del LED fino alla luce affinché non ci siano ostruzioni visibili. Colpo sul foro per eliminare eventuali ostruzioni Se necessario e inserire il cavo di patch optogenetica nell'apertura.
- Collegare la cannula di fibra ottica per il cavo di patch optogenetica inserendo la cannula in entrambe le estremità del manicotto connettore. Collegare l'altra estremità del manicotto connettore per il cavo di patch. Applicare una pressione sufficiente a garantire la connessione, ma fare attenzione a non piegare o rompere la fibra ottica nella cannula.
Nota: La cannula di fragile fibra ottica è coperto con il cappuccio di protezione ogni volta che il laser non è in uso. - Impostare il driver di LED per la modalità onda continua (CW) con la manopola di regolazione continua a 0 e il limite di corrente impostato su 1,2 A.
2. fotoconversione delle cellule del colon
Nota: Topi maschi e femmine sono stati esposti alla luce di intracolonic 405 nm 1-2 giorno (i) dopo la loro nascita e sono stati sacrificati prima di 1 settimana di età.
- Garantire un luogo buio con un accesso ad una presa elettrica. Inserire il driver del LED la presa.
Nota: Questa procedura viene eseguita nella minima luce bianca come una lunga esposizione dei topi alla luce dell'ambiente può causare un indesiderato fotoconversione delle cellule. Luce rossa è utilizzato come alternativa.
Attenzione: Il passo successivo prevede l'utilizzo di un animale anestetico. La somministrazione di anestetico si svolge in una cappa di classe II o utilizzando un altro sistema di lavaggio appropriato. L'inalazione dell'anestetico può causare capogiri, sonnolenza o anche uno stato di incoscienza. - Anestetizzare il mouse dall'esposizione all'isoflurano 4-5% a 100% O2 in una scatola di induzione. Verificare la corretta profondità di anestesia pinzando saldamente una zampa posteriore (nessuna risposta). Mantenere l'anestesia tramite un cono di naso a circa il 2% isoflurane. Evitare l'esposizione del gestore a isoflurano dall'uso di un'appropriata cappa o anestetico dispositivo scavenging.
- Posizionare il mouse anestetizzato per l'esposizione di intracolonic utilizzando 1 mano a collottola sul retro del mouse delicatamente con il dito indice e il pollice. Capovolgi il mouse per esporre l'addome. Se il mouse comincia a perdere il suo colore rosa o se il tasso di respirazione inizia a rallentare, allentare la presa. Fissare la coda del mouse tra l'anulare e il mignolo.
- Con l'altra mano, rimuovere il cappuccio protettivo dalla cannula. Pur mantenendo l'asse lungo della cannula parallela alla linea mediana del mouse, inserire delicatamente la cannula di fibra ottica attraverso l'ano nel colon affinché tutti i 5mm della fibra ottica sono all'interno del mouse.
Nota: Questa procedura viene eseguita lentamente e con attenzione a non forare la parete colica. Minuto dimenando e torsione della cannula aiuta l'avanzamento nel colon. - Indossare gli occhiali di sicurezza e aumentare il laser corrente al valore massimo (tutto in senso orario). Confermare la presenza di luce UV guardando l'addome traslucido del mouse.
Nota: Gli occhiali di protezione laser LG3 diminuiscono drasticamente la visibilità. Sono un collega (dispositivi di protezione da portare) aiutare a indossare gli occhiali e accendere il laser. - Esporre il colon per la luce laser per un totale di 2 min. ritirare la cannula circa 1 mm ogni 30 s per massimizzare l'area luminal esposto alla luce. Alla fine di 2 min, spegnere il laser.
- Rimuovere lentamente la cannula dal mouse. Dopo il recupero dall'anestesia in una gabbia calda vuota, tornare il mouse dalla gabbia.
3. isolamento dei linfociti intestinali
- Preparare 1 L di tampone di siero (HBSS/CS) soluzione salina bilanciata/vitello di Hank, 200 mL di tampone epiteliale striscia, 500 mL di lavaggio mezzi e 200 mL dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)-lavare i media liberi.
Nota: I volumi di reagente sono calcolati per una dimensione del campione di 9.- Rendere il buffer HBSS/CS (HBSS; 5% CS) aggiungendo 50 mL di CS a 950 mL di HBSS. Memorizzata sul ghiaccio.
- Preparare il tampone di striscia epiteliali [HBSS; 5% CS; 1 mM dithiothreitol (DTT); 5 mM EDTA acido di 15mm 4-(2-Hydroxyethyl) piperazina-1-etansolfonico (HEPES) (pH 7.2-7.5)] aggiungendo 10 mL di CS, 200 µ l di 1 M DTT, 2 mL di EDTA 0.5 M e 3 mL di tampone HEPES 1m a 185 mL di HBSS. Posto il buffer di striscia epiteliale in bagnomaria a 37 ° C.
- Fai il media di lavaggio (HBSS; 1% CS; 1 mM EDTA) aggiungendo 5 mL di CS e 1 mL di EDTA 0,5 M a 494 mL di HBSS. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare il supporto di lavaggio senza EDTA (HBSS; 1% CS; 15 mM HEPES) con l'aggiunta di 2 mL di CS e 3 mL di 1 M HEPES a 195 mL di HBSS. Conservare a temperatura ambiente.
- Rendere un FACS buffer [1x tamponato fosfato salino (PBS) (pH = 7.2); 2% CS] con l'aggiunta di 10 mL di CS a 490 mL di PBS. Memorizzata sul ghiaccio.
- Preparare il piatto di raccolta del tessuto inserendo un colino di cella µm 70 all'interno di una piastra di coltura 60 x 10 mm. Aggiungere 10 mL di tampone HBSS/CS (HBSS; 5% buffer di CS effettuata nel passaggio 3.1.1 e conservati nel ghiaccio) al piatto e posizionarlo sul ghiaccio.
- Eutanasia il mouse tramite un'overdose di inalazione isoflurane utilizzando lo scavenging appropriato di anestetico (un'esposizione di circa 3 min a > 4% isoflurane nell'aria della stanza o in 100% O2). Dopo apparente cessazione della respirazione e reflex movimento, verificare l'assenza di dolore profondo pinzando saldamente una zampa posteriore (usando il forcipe è consigliato). Garantire l'eutanasia tramite una decapitazione utilizzando un paio di forbici chirurgiche o un rasoio nuovo.
Nota: Dislocazione cervicale non è raccomandata per questo passo a causa delle dimensioni e l'età dell'animale. Questi metodi sono coerenti con le linee guida AVMA 2013 sull'eutanasia e approvato dal MGH IACUC. - Raccogliere il colon usando pulite pinze e le forbici per aprire l'addome. Riflettere gli intestini al 1 lato dell'addome del mouse per esporre i due punti. Rimuovere tutto il colon transecting primo esso appena distale (verso l'ano) al cieco. Quindi, mentre afferrando saldamente i due punti con il forcipe, usare le forbici per tagliare attraverso l'uretra, il retto. Tagliare i due punti come vicino all'ano come possibile. Raccogliere la milza dopo la rimozione del colon (Vedi punti 4.1-4.2 qui sotto).
Nota: Mentre il protocollo di fotoconversione destinato solo a ~ 25% dei due punti del neonato (5 mm della cannula fibra ottica), tutto il colon è raccolto per facilitare l'isolamento delle cellule. - Pulizia del colon usando il forcipe per spingere il contenuto fuori del colon e su un tovagliolo di carta a secco. Omogeneizzare il tessuto utilizzando lamette per tritare finemente i due punti in una pasta sulla copertina di una piastra di coltura e poi trasferire questa pasta al filtro cella in di Petri.
- Aggiungere un ancoretta magnetica lunga 8mm pulito il filtro e collocare il piatto su un piatto di agitatore magnetico 9-posizione. Impostare la velocità di barra magnetica a 800 giri/min e incubare le cellule per 5 min a temperatura ambiente. Scartare il buffer e ripetere il lavaggio utilizzando 10 mL di HBSS/CS (L'HBSS; 5% buffer di CS effettuata nel passaggio 3.1.1 e conservati nel ghiaccio). Scartare il buffer alla fine del lavaggio.
- Dissociare le cellule epiteliali con l'aggiunta di 10 mL di tampone preriscaldati striscia epiteliale (L'HBSS; 5% CS; 5mm EDTA; 1 millimetro DTT, tampone HEPES [pH 7.2-7.5] di 15mM che è stato fatto nel passaggio 3.1.2 e memorizzati in bagnomaria a 37 ° C) al filtro cella e mescolare a 800 rpm per 30 min in un 3 Incubatrice di 7 ° C. Al termine dell'incubazione, l'arricchito nella frazione epiteliale ad un tubo pulito da 15 mL di buffer di trasferimento.
Nota: L'epitelio e associato le cellule (cellule epiteliali intestinali e i linfociti epiteliali intestinali) vengono rilasciate nel buffer, mentre le cellule nel intatto della lamina propria rimangono sul filtro cella durante questo passaggio11.- Centrifugare la frazione epiteliale intestinale arricchita (IELs) a 700 x g per 5 min a temperatura ambiente. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di FACS. Memorizzarlo sul ghiaccio per uso nel punto 3.15.
- Lavare la frazione della lamina propria all'interno del filtro cella 2 x con HBSS/CS. A tale scopo, aggiungere 10 mL di soluzione HBSS/CS (HBSS; buffer di CS 5% che è stato fatto nel passaggio 3.1.1 che è stato memorizzato sul ghiaccio) al filtro cella e mescolate a 800 rpm per 5 min in un incubatore a 37 ° C. Eliminare il buffer dopo ogni lavaggio.
- Lavare il campione 2 x lavaggio media. Aggiungere 10 mL di lavaggio media (HBSS; 1% CS; soluzione tampone dell'EDTA 1 mM che è stato fatto nel passaggio 3.1.3 e conservato a temperatura ambiente) al filtro cella e mescolate a 800 rpm per 15 min in un incubatore a 37 ° C. Eliminare il buffer dopo ogni lavaggio.
- Dopo aver utilizzato i media di lavaggio, memorizzarlo sul ghiaccio per l'utilizzo nel passaggio 3.14.
- Lavare il campione 2 x con HBSS/CS. aggiungere 10 mL di tampone HBSS/CS (HBSS; buffer di CS 5% fatta al punto 3.1.1 è stato archiviato in ghiaccio) al filtro cella e mescolate a 800 rpm per 5 min in un incubatore a 37 ° C. Eliminare il buffer dopo ogni lavaggio.
- Incubare il tessuto nel tampone di lavaggio senza EDTA. Aggiungere 10 mL di tampone di lavaggio senza EDTA (HBSS; 1% CS; tampone HEPES 15 mM che è stato fatto nel passaggio 3.1.4 e conservato a temperatura ambiente) al filtro cella e incubare la piastra per 10 min a temperatura ambiente senza mescolare. Scartare il buffer alla fine di questo passaggio.
- Lavare il campione 2 x con HBSS/CS e preparare la soluzione di enzima. Aggiungere 10 mL di HBSS/CS (HBSS; buffer di CS 5% effettuata nel passaggio 3.1.1 che è stato memorizzato sul ghiaccio) nel buffer al filtro cella e mescolate a 800 rpm per 10 min in un incubatore a 37 ° C. Eliminare il buffer dopo ogni lavaggio.
- Preparare la soluzione di enzima (privo di EDTA lavare buffer; 0,1 mg/mL dnasi I; collagenosi 167 mg/mL) durante il secondo periodo di lavaggio: aggiungere 9 mg di dnasi I e 15 mg di liofilizzato collagenosi a 90 mL di EDTA-free il tampone di lavaggio. Conservare la soluzione a temperatura ambiente.
- Digerire la frazione propria di lamina contenuta nel colino cella per ottenere i linfociti della lamina propria (LPLs). Aggiungere 10 mL della soluzione enzimatica (EDTA-libero il tampone di lavaggio; 0,1 mg/mL dnasi I; 167 mg/mL di tampone di collagenasi effettuata nel passaggio 3.12.1 e conservato a temperatura ambiente) al filtro cella e mescolate a 800 rpm per 45 min in un incubatore a 37 ° C.
Nota: LPLs vengono rilasciati nella soluzione dopo la digestione enzimatica.- Raccogliere la soluzione enzima contenente le celle e filtrarlo attraverso un colino di cella nuova in una provetta conica da 50 mL.
- Aggiungere 20 mL di media di lavaggio a freddo (L'HBSS; 1% CS; 1mM EDTA tampone fatta al punto 3.1.3 e memorizzati sul ghiaccio nel passaggio 3.9.1) alle cellule filtrate per bloccare l'attività della collagenosi nella soluzione degli enzimi. Centrifugare la provetta a 700 x g per 6 min a temperatura ambiente. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet contenente LPLs in 1 mL di tampone di FACS.
- Combinare la IEL (dal punto 3.7.1) e le frazioni LPL (dal punto 3.14) e li macchia con anticorpi coniugati fluorescenti per l'analisi cytometric di flusso (vedi passo 5).
Nota: IEL e LPL frazioni possono essere macchiate separatamente se non si desidera informazioni di vano.
4. isolamento dei linfociti dalla milza
- Preparare il tubo di raccolta aggiungendo 500 µ l di tampone di FACS in un tubo del microcentrifuge. Memorizzarlo sul ghiaccio.
- Dopo aver rimosso i due punti (punto 3.4), raccogliere la milza intera e inserirlo nel tubo di raccolta. Conservare il tessuto sul ghiaccio.
- Utilizzando un omogeneizzatore del tessuto elettrico, omogeneizzare milza in una microcentrifuga per circa 1 min. Centrifugare il campione a 300 x g [micro centrifuga] per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il sovranatante.
- Per eseguire la lisi dei globuli rossi, risospendere il campione in 500 µ l di tampone di lisi di ammonio-cloruro-potassio (ACK) per avviare la morte cellulare da lisi osmotica. Lasciare il campione Incubare per 1-2 minuti a temperatura ambiente e poi e risospendere in 725 µ l di tampone di FACS.
- Centrifugare il campione a 300 x g [micro centrifuga] per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il sovranatante. Risospendere il pellet in 500 µ l di tampone di FACS e filtrarlo attraverso un colino di cella di 40 µm in un nuovo tubo del microcentrifuge. L'intero campione di trasferimento ad un nuovo tubo del microcentrifuge e macchia con anticorpi coniugati fluorescenti per l'analisi cytometric di flusso (vedi passo 5).
5. identificazione di Dendra-r+ cellule tramite flusso Cytometry
- Centrifugare i campioni IEL/LPL e milza a 300 x g [micro centrifuga] per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il sovranatante.
- Risospendere il pellet in 100 µ l di anticorpo che macchia mix. Preparare l'anticorpo che macchia mix aggiungendo 1 µ l di anticorpo fluorescente coniugato anti-CD45 a 100 µ l di tampone di FACS per campione.
Nota: È importante a titolare gli anticorpi utilizzati per la citometria di flusso prima dell'esperimento per determinare la concentrazione ottimale dove si verifica la saturazione di associazione. - Incubare i campioni per 35 min su ghiaccio (in un luogo buio).
- Risospendere i campioni a 300 µ l di tampone di FACS e li Centrifugare a 300 x g [micro centrifuga] per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere i campioni in 325 µ l di tampone di FACS. Analizzare i campioni su un citometro a flusso.
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Representative Results
Un cavo in fibra ottica è stato utilizzato per trasportare 405 nm luce in due punti dei topi diasportato 2 - giorno-vecchi PhAM. In precedenti esperimenti, un 30 s esposizione era deciso a dare una massima fotoconversione delle cellule del colon con minima citotossicità (Figura 1A). Di conseguenza, sequenziale 30 esposizioni di s dei diversi segmenti del colon sono state effettuate come descritto nel protocollo. In seguito l'esposizione del laser, i topi sono stati immediatamente eutanasizzati e fotoconversione delle cellule è stata determinata. Preparazioni di singole cellule del tessuto colico totale erano macchiati con anticorpo fluorescente-coniugato anti-CD45 e l'analisi cytometric di flusso è stato effettuato per rilevare fotoconversione. Non convertito Dendra2-verde (Dendra-g) proteine ha maxima di eccitazione e di emissione a 490 e 553 nm rispettivamente e possono essere rilevata nel canale FITC, mentre photoconverted proteina Dendra2-rosso (Dendra-r) ha maxima di eccitazione e di emissione a 507 e 573 nm rispettivamente e può essere rilevato nel canale PE di un citometro a flusso. Una volta acceso irreversibilmente alla sua forma rosso, Dendra2 è altamente fotostabili e utile per applicazioni di monitoraggio a lungo termine.
Nessuna cellula di Dendra-r+ sono stata rilevata nei topi unlasered (Figura 1B a sinistra). Tuttavia, l'esposizione alla luce 405 nm provocato distinte popolazioni di cellule di Dendra-r+ CD45 sia CD45neg + cell scomparti (Figura 1B a destra). Per determinare se il protocollo di fotoconversione colica ha provocato il contrassegno di sfondo delle celle presso siti extra-intestinali, abbiamo vendemmiato milze da appena photoconverted topi (T = 0) e analizzati per Dendra-r+ cellule tramite flusso cytometry. Nessuna cellula di Dendra-r+ sono stata rilevata nel CD45neg o CD45+ cell scomparti (Figura 1C), suggerendo che il raggio laser intra-colica non ha penetrato abbastanza per photolabel cellule nella milza. Così, tutte le celle di Dendra-r+ rilevate nella milza dopo tempo permettendo per la migrazione (T = 3d, 5D) dovrebbe provenire dal colon.
Figura 1 : In vivo fotoconversione di tessuto colico. Le cellule del colon da 2 - giorno-vecchio PhAMasportato cuccioli sono stati esposti a intra-colica 405 nm luce per 30 s come descritto. La fotoconversione e l'etichettatura delle cellule sono stati determinati immediatamente dopo la procedura (T = 0) da un'analisi cytometric di flusso delle preparazioni di singole cellule del tessuto colico e milza. (A), questa trama di dot cytometric di flusso rappresentante Mostra l'espressione di CD45 (x-axis) e la macchiatura della tintura vive-morte (y-asse) in cella singola preparati da due punti di controllo e topi laserati. Pannelli B e C sono rappresentante flusso cytometric dot plot sovrapposizioni che mostrano l'espressione della proteina Dendra2-verde (Dendra2-g, ad asse orizzontale) e la proteina Dendra2-rosso (Dendra2-r, asse verticale) in non impressionate di controllo e esposti CD45+ (ematopoietiche) e cellule di CD45neg (non-emopoietici) in (B) il colon e il (C) la milza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Dati da un esperimento di fotoconversione tipico per identificare le cellule migratorie nella milza sono mostrati in Figura 2. La fotoconversione delle cellule in due punti dei topi diasportato 2 - giorno-vecchi PhAM è stata eseguita come in Figura 1. Topi sono stati eutanasizzati 3 e 5 giorni dopo l'esposizione e la presenza di cellule di Dendra-r+ nella milza è stata determinata mediante citometria a flusso. C'erano nessuna cellula di Dendra-r+ nel sottoinsieme delle cellule CD45neg , coerente con la vista che le cellule dineg CD45 sono principalmente epiteliale ed altre cellule strutturali dell'intestino. Alcuni CD45+ cellule ematopoietiche espresso Dendra-r, suggerendo che erano stati photoconverted nel colon e migrato alla milza.
Figura 2 : CD45+ cellule ematopoietiche migrano dal colon alla milza. Neonato (0 - 2 del giorno) PhAMasportato topi sono stati esposti a 405 nm luce alla proteina fotoconvertita Dendra2 dall'esposizione intra-colica. Le trame di citometria a flusso rappresentativo mostrano l'espressione della proteina Dendra2-verde (Dendra2-g, ad asse orizzontale) e la proteina Dendra2-rosso (Dendra2-r, asse verticale) in CD45neg e CD45+ cellule della milza dei non esposti 5-giorno-vecchi topi e esposto i topi analizzati a 3 e 5 giorni (T = 3d, 5D) dopo la fotoconversione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'identificazione e la caratterizzazione delle cellule che interagiscono e sono influenzati dal microbiota del colon sono importanti e dovrebbero facilitare la comprensione di come le informazioni dal microambiente mucoso viene inoltrati al resto del corpo. Un metodo per studiare la migrazione delle cellule dell'intestino richiede l'isolamento di cellule associato all'intestino, seguita da un trasferimento adottivo in topi destinatari per determinare i modelli di tessuto-homing e funzione12,13. Questo approccio è limitato, come solo i tipi cellulari specifici che sono stati trasferiti possono essere monitorati. Ulteriormente, gli artefatti causati dall'isolamento delle cellule dai tessuti e il processo di purificazione possono ostacolare il processo migratorio in vivo . Più recentemente, un protocollo di fotoconversione endoscopica per marcare le cellule intestinali, utilizzando topi Kaede aveva segnalato14. Questo studio ha trovato un vasto traffico di leucociti da e verso l'intestino in topi adulti.
Il nostro rapporto descrive un metodo per le cellule di etichetta nel colon dei topi neonati e tenere traccia di loro migrazione siti extra-intestinali come la milza. Il mouseasportato PhAM ubiquistmente esprime una proteina Dendra2 di fotoconvertibile verde fluorescente che è irreversibilmente acceso a fluorescenza rossa al momento della sua attivazione dalla luce UV. L'esposizione dei due punti dei topi neonati a 405 nm luce etichettati entrambi CD45+ ematopoietiche e delle cellule non-emopoietici di CD45neg . CD45++ Dendra2-rosso cellule sono state rilevate nella milza 3-5 giorni dopo la fotoconversione, che indica la migrazione extra-intestinale delle cellule ematopoietiche.
La tappa limitante per questa analisi è la frazione della zona colica che è esposto a 405 nm luce. La fragilità del colon appena nato e la presenza di feci, seppur minima in età così precoce, limitare la lunghezza della cannula fibra ottica che possa essere inserita. In precedenti esperimenti, una cannula più lungo potrebbe non essere inserita con successo più di 5 mm. Lubrificanti sono stati evitati a causa del rischio della rifrazione della luce variabile del fascio laser. Il movimento verso l'esterno della cannula ogni 30 s ha aiutato a massimizzare l'area di Colico esposto alla luce laser. Cosa importante, una cannula con un grande valore di NA (NA = 0.5) è stato utilizzato per generare un ampio cono di luce nel colon.
Questo protocollo è stato standardizzato per neonato (0 - 2 del giorno) PhAMasportato cuccioli. Dati i cambiamenti nel contenuto e la lunghezza del colon con l'età dei topi, la tecnica dovrà essere ottimizzato di conseguenza quando si utilizza vecchi cuccioli. Principalmente, le modifiche alla durata totale della fotoconversione e la lunghezza dell'inserimento della cannula fibra ottica sarà necessarie.
Questo approccio alla comprensione del comportamento migratorio delle cellule del colon è facilitato da analisi cytometric di flusso. Citometria a flusso multiparametrica può essere ulteriormente utilizzata per identificare e fenotipo i migranti delle cellule immuni di tipi all'interno il CD45+ cell sottoinsieme. Cellule Dendra2-r+ possono anche essere filtrate FACS per applicazioni a valle quali analisi di profilazione o di proteomica di espressione genica. Mentre, verso la comprensione dei sottoinsiemi di cellule ematopoietiche nel colon in questo studio, il metodo può essere adattato per studiare la migrazione cellulare da siti di tessuto supplementare compreso il cervello e la pelle.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Nitya Jain è stato sostenuto da un premio di transizione di carriera NIH/NIAID 1K22AI116661-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
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