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Genetics

Criblage de surexpression axée sur l’accouplement chez la levure

Published: July 6, 2018 doi: 10.3791/57978
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Wright State University

Summary

Cet article présente une méthode basée sur l’accouplement afin de faciliter le dépistage surexpression dans la levure de bière en utilisant une bibliothèque de plasmide rangés.

Abstract

La levure de bière a été largement utilisée comme un modèle dans l’étude des protéines associées à des maladies humaines. Génome-large dépistage génétique est un outil puissant couramment utilisé dans les études de levure. L’expression d’un certain nombre de protéines associés à la maladie neurodégénérative levure provoque la cytotoxicité et formation globale, récapitulant les résultats observés chez les patients atteints de ces troubles. Nous décrivons ici une méthode de dépistage d’un modèle de la levure de la protéine associée à la sclérose latérale amyotrophique FUS pour les modificateurs de sa toxicité. Au lieu d’utiliser la transformation, cette nouvelle plateforme de projection s’appuie sur l’accouplement de levure pour introduire une bibliothèque déployèrent des plasmides dans le modèle de levure. La méthode d’accouplement a deux avantages : Premièrement, il est très efficace ; Deuxièmement, la bibliothèque déployèrent préalablement transformée des plasmides peut être conservée pendant à long terme comme un stock de glycérol et rapidement appliquée aux autres écrans sans la fastidieuse étape de transformation dans le modèle de levure chaque fois. Nous montrons comment cette méthode peut être utilisée avec succès pour dépister les gènes qui modifient la toxicité du FUS.

Introduction

La levure Saccharomyces cerevisiae a été employé couramment dans la recherche scientifique fondamentale1 pour comprendre les processus cellulaires directement liés aux maladies humaines. En outre, il a été utilisé comme un organisme modèle pour étudier les protéines associées à la maladie humaines, telles que celles liées aux maladies neurodégénératives plus courants, y compris la maladie d’Alzheimer, de Parkinson, la maladie de Huntington et amyotrophique Latérale amyotrophique (SLA)2. Un avantage du modèle levure est la facilité avec laquelle un génome-large écran peut être effectué afin d’identifier des voies cellulaires liés à la toxicité des protéines liées à la maladie, ce qui donne un aperçu sur le mécanisme de leur toxicité. Un tel écran est appelé un écran Bibliothèque surexpression, dans lequel chacun des 5 500 gènes levure dans une bibliothèque qui se transforme en un modèle de levure pour identifier quels gènes peuvent modifier la toxicité lorsque surexprimés. Cette méthode de dépistage a été appliquée avec succès dans les modèles de la levure de multiples protéines associés à la maladie de neurodégénératives, y compris la huntingtine pour la maladie de Huntington3, α-synucléine pour la maladie de Parkinson4,5 , Bêta-amyloïdes de la maladie d’Alzheimer,6et FUS et TDP-43 ALS7,8,9. Alors qu’il est généralement fait dans une manière haut débit10, l’étape la plus fastidieuse de l’écran se transforme individuellement 5 500 gènes de levure d’une bibliothèque de rangées. Cette étape doit être exécutée chaque fois que la projection est répétée, et chaque fois qu’un modèle de levure nouvellement créé doit être étudié. Il est important de trouver un moyen plus efficace pour accomplir cette tâche.

Les cellules de levure peuvent exister stablement sous forme haploïde et diploïde. Il y a deux en face de l’accouplement des types de cellules haploïdes, l’accouplement de type a et α. cellules haploïdes de chaque croisement type produire et sécrètent leur propre phéromone accouplement spécifique, auxquels répondent seules les cellules de type sexuel opposé. Cela permet l’accouplement entre un et α des cellules pour produire des cellules diploïdes stables, a/α. Ce processus est spontanée et très efficace11. Nous pouvons tirer profit de ce cycle de vie unique de S. cerevisiae d’introduire de la bibliothèque de plasmide. Plus précisément, chaque gène dans la bibliothèque de plasmide déployèrent se transformeront en cellules haploïdes d’un type sexuel, c'est-à-dire, cellule α. Ces cellules contenant les gènes de la bibliothèque seront alors stockées en stock de glycérol dans un format de 96 puits rangé. Pour chaque modèle de levure qui doit être projeté, contenant les gènes de la bibliothèque de cellules de levure peuvent être décongelés sur le stock de glycérol, et le dépistage peut être effectué via l’accouplement avec le modèle de levures d’intérêt dans le type sexuel opposé, c'est-à-diretype sexuel un. Cette idée d’utiliser l’accouplement de réunir les deux gènes dans la levure n’est pas nouveau. Elle a été appliquée avec succès dans la levure de haut-débit dépistage-hybride, dans lequel un appât construire (p. ex.fusions de Gal4-DNA-binding domain) dans un seul type d’accouplement est réuni par accouplement avec une proie de construction d’une bibliothèque de rangées 12. Toutefois, cette stratégie n’a jamais été appliquée dans la surexpression bibliothèque de films, qui ont toujours utilisé les méthodes traditionnelles de transformation.

Notre laboratoire a déjà établi un modèle de la levure de la protéine associée aux ALS FUS7. Par le biais de criblage de surexpression en utilisant la méthode de transformation, nous avons découvert cinq gènes de la levure (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1et VHR1) que sauver la toxicité du FUS lorsque surexprimés. Ces résultats ont été indépendamment confirmés avec une étude similaire réalisée par un autre groupe8. hUPF1, un homologue humain du ECM32, s’est avéré par la suite supprimer la toxicité des cellules neuronales primaires13 et dans un modèle animal de ALS14 établissements. À l’aide de ces cinq gènes comme preuve de principe, nous démontrons que tous les cinq gènes secourir de même toxicité FUS lorsqu’ils sont introduits dans le modèle de levure FUS par l’accouplement. Puisque les cellules de levure contenant les gènes de la bibliothèque peuvent être stockés en permanence en stock de glycérol et relancés chaque fois que nécessaire, cette méthode basée sur l’accouplement supprime la longue étape de transformation chaque fois que la bibliothèque doit être projeté contre. Étant donné que l’accouplement est très efficace avec aucune transformation de plasmide impliquée, cette stratégie diminue également de façon significative le coût associé à la purification et la transformation d’une bibliothèque de gros plasmide. Nous appliquerons avec succès cette méthode dans une bibliothèque de dépistage contre le modèle de la levure du FUS.

La procédure de dépistage basé sur l’accouplement est brièvement décrite à la Figure 1. Au départ, la bibliothèque du plasmide qui se transforme en une souche de levure haploïde de l’accouplement de type α, en utilisant un protocole de transformation de levure de haut-débit dans lesquels chaque puits d’une plaque 96 puits contient levure transformée avec un plasmide de bibliothèque spécifique. Cette collection de levure transformée est enregistrée comme un stock de glycérol qui peut être décongelé et relancé pour une utilisation plus tard. Le modèle de levures d’intérêt, dans cette affaire toxicité FUS, doit être généré dans une souche de levure haploïde avec le type sexuel opposé (type sexuel un). D’une manière de haut débit utilisant des réplicateurs de 96 broches stériles, le FUS souche souches de levure contenant la bibliothèque de plasmide transférés à plaques à 96 puits contenant des médias riches et sont autorisés pour s’accoupler. Après l’accouplement, un petit volume de chaque puits de la culture d’accouplement est transféré à plaques à 96 puits contenant des médias synthétiques d’abandon dans lequel levure uniquement diploïde contenant les deux Dug et gènes de bibliothèque peuvent se développer. Une machine robotisée tache sert ensuite de transférer la culture de levure de chaque puits, sur plaques de gélose, où l’expression des gènes Bibliothèque et FUS est induite.  En outre, culture de levure est repérée pour contrôler les boîtes de gélose où FUS et les gènes de bibliothèque ne sont pas exprimées. Après une croissance sur milieu gélosé, gènes de sauvetage ou d’aggravent la toxicité FUS seront identifiés.

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Protocol

Remarque : Le protocole décrit ici est conçu pour le dépistage des plasmides de bibliothèque contenues dans dix plaques de 96 puits mais peut évoluer vers le haut ou vers le bas en conséquence. Le protocole doit être répété pour compléter l’examen préalable de toute bibliothèque. Généralement, dépistage de 10 plaques de gènes de la bibliothèque chaque fois peut être confortablement géré par 1 personne.

1. préparation pour la Transformation de la levure de 96 puits

Remarque : Cette étape est faite comme précédemment décrit7,10.

  1. Aliquote 5 µL (environ 50 à 100 ng) de l’ADN d’une bibliothèque de plasmide déployèrent dans chaque puits d’une plaque de 96 puits fond rond de plasmide.
    Remarque : Un exemple d’une telle bibliothèque serait une levure gène surexpression bibliothèque10.
  2. Inoculer 150 mL de levure peptone dextrose (DPJ) médias dans un ballon jaugé de 500 mL avec une colonie (2 – 3 mm de diamètre) de la souche de levure haploïde W303α. Les incuber pendant la nuit à 30 ° C sous agitation (200 tr/min).
  3. Le lendemain matin, mesurer l' OD600 de la culture au jour le jour et diluer la culture de levure à OD600 = 0,1 (jusqu'à) 2 l de la DPJ. Incuber à 30 ° C sous agitation (200 tr/min) pendant environ 5 h, jusqu'à ce que la culture atteint OD600 = 0,4 à 0,6.

2. Transformation de levure

  1. Récolte de la culture de levure par 8 bouteilles de centrifugeuse stérile 250 mL de remplissage et leur centrifugation à température ambiante à 3 000 g pendant 10 min. décanter le liquide surnageant sans déranger le culot.
    NOTE : Effectuer toutes les étapes de centrifugation à température ambiante.
  2. Laver la levure avec stérile distillée H2O. Pour ce faire, ajouter 100 mL de stérile H2O à chaque bouteille de la centrifugeuse et le vortex à Resuspendre le culot cellulaire. Combiner les cellules lavées dans 2 bouteilles et centrifuger à 3 000 g pendant 5 min. décanter le liquide surnageant.
  3. Laver les cellules dans chaque bouteille dans 100 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE (100 mM LiOAc ; 10 mM Tris, pH 8,0 ; 1 mM EDTA) et les centrifuger à 3 000 x g pendant 5 min. Pour désactiver le surnageant.
  4. Pendant la centrifugation, faites bouillir 5 mL de sperme de saumon ADN (10 mg/mL) à 100 ° C à l’aide d’un chauffe-bloc pendant 3 min et puis refroidir sur glace.
  5. Resuspendre le culot dans 25 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE dans chaque bouteille, combiner les cellules resuspendues et transférez-les sur un flacon de 150 mL. Ajouter 5 mL de sperme saumon refroidi préalablement ADN et il incuber à 30 ° C sous agitation (225 tr/min) pendant 30 min.
  6. Versez le mélange de cellules dans un réservoir jetable stérile et, à l’aide d’une pipette multicanaux, transférer 35 µL du mélange cellulaire dans chaque puits de la plaque à 96 puits fond rond contenant l’ADN de plasmide de bibliothèque. Plaques de Vortex le 96 puits à l’aide d’une plaque vortexer pendant 1 min à 1 000 tr/min. Incuber les boîtes pendant 30 min à 30 ° C sans agitation.
    Remarque : Ne pas empiler les plaques, donc la chaleur peut transférer plus efficacement. Nous avons constaté que Vortex les plaques 96 puits à 1 000 tr/min ne provoque pas de liquide se répandre hors du puits, mais une vitesse sécuritaire vortex doit être testée avant de passer à l’étape.
  7. Dans une fiole, préparer 200 mL du tampon transformation contenant une concentration finale de 40 % PEG3350, 10 % DMSO et 0,1 M LiOAc. Préparer le tampon de transformation immédiatement avant utilisation et bien mélanger en agitant.
  8. Supprimer 96 plats de l’incubateur à 30 ° C et mélanger pendant 30 s à 1 000 tr/min à l’aide de la plaque vortexer. Ajouter 125 µL de tampon de la transformation à chaque puits et puis vortex les plaques pendant 1 min à 1 000 tr/min.
  9. Incuber les plaques à 30 ° C pendant 30 min et puis chauffer choc la levure en plaçant les plaques dans un incubateur à 42 ° C pendant 15 min.
    Remarque : Ne pas empiler les plaques.
  10. Centrifuger les plaques pendant 5 min à 3 000 x g. Retirer le tampon de la transformation des puits en inversant les plaques sur une poubelle et le dumping avec force la mémoire tampon des plaques. Rapidement, épongez les plaques inversées sur une serviette en papier propre pour enlever n’importe quel liquide sur le dessus des plaques.
  11. Rincer les cellules en ajoutant à la plaques 200 µL d’un minimum d’abandon moyen correspondant au marqueur sélectionnable sur le plasmide de bibliothèque.
    NOTE : Nous avons utilisé un Ura-milieu synthétique.
  12. Centrifuger les plaques pendant 5 min à 3 000 x g et éliminer le surnageant sur une poubelle comme au point 2.10.
  13. Ajouter 160 µL de minimes Ura-milieu contenant 2 % de glucose. Vortex les plaques pendant 1 min à 1 000 tr/min et les incuber à 30 ° C pendant 48 h sans agiter. Après 48 h, Notez qu’une pastille de levure transformée est visible au bas de chaque puits.
  14. À l’aide d’un distributeur de liquide, ajouter 100 µL de glucose contenant Ura-médias dans chaque cupule d’un nouvel ensemble de plaques de 96 puits.
  15. Vortex les plaques contenant de la levure transformée (de l’étape 2.13) à 1 000 tr/min pendant 30 s. à l’aide d’un réplicateur de 96 broches en plastique stérile, placez les chevilles dans les puits contenant de la levure transformée et puis leur inoculer dans les puits correspondants des nouvelles plaques rempli de médias. Le nouveau incuber à 30 ° C pendant 24 h.
    NOTE : Si vous travaillez avec 10 plaques, le milieu peut également être dispensé manuellement à l’aide de pipettes multicanaux.
  16. Après 24h, une pastille de levure doit être visible dans le fond de chaque puits contenant de la levure transformée avec succès. Pour enregistrer ces souches de levures dans les stocks de glycérol, ajouter 50 µL de glycérol à 50 % dans chaque puits, vortex les plaques pendant 30 s à 1 000 tr/min, sceller les plaques avec du ruban d’étanchéité et congeler à-80 ° C.
    Remarque : Les étapes ci-dessus suffit à être exécutée une fois. Futures projections de modèles différents de levure contre le même réservoir de réactif jetable de bibliothèque peuvent commencer provenant des stocks de glycérol et procéder immédiatement de la procédure ci-dessous.

3. l’accouplement entre les cellules qui contiennent des gènes de la bibliothèque et de la levure de requête

  1. Afin de raviver les souches de bibliothèque sur le stock de glycérol, prendre les plaques de 96 puits sortis du congélateur-80 ° C, retirez la bande d’étanchéité et laissez la levure décongeler à température ambiante pendant environ 30 min.
  2. Une fois que la levure a dégelé, utilisez un réplicateur de 96 broches en plastique stérile pour inoculer les stocks de glycérol à 160 µL de frais Ura-médias contenant 2 % de glucose en plaques 96 puits et les incuber à 30 ° C pendant 24 h. immédiatement après que les souches de bibliothèque sont utilisés , sceller les plaques avec bande d’étanchéité et les ramener au congélateur à-80 ° C.
  3. Le même jour, les souches de la bibliothèque (W303α) sont décongelés, inoculer la souche de levure de requête (en l’occurrence, FUS en W303a) à 50 mL de la DPJ et développez-le du jour au lendemain à 30 ° C sous agitation à 250 tr/min.
  4. Le lendemain, verser la souche de levure de requête à un réservoir de réactif jetable stérile et aliquote 160 µL de la souche de requête pour chaque puits d’une plaque 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux.
  5. Utilisation du distributeur de liquid, distribuer 160 µL des médias de la DPJ dans chaque puits de dix plaques de 96 puits. Utiliser ces plaques plus tard pour l’accouplement de la souche de levure de requête avec la levure de la bibliothèque.
  6. Brièvement, vortex la plaque à 96 puits contenant la souche de la requête, puis utilisez un réplicateur 96 broches stérile pour transférer la requête souche pour les plaques de la DPJ.
  7. Brièvement le vortex la bibliothèque plaques de la souche et, pour chaque plaque de souche de bibliothèque, utiliser un nouveau réplicateur de 96 broches stérile pour transférer les souches de bibliothèque pour les plaques de la DPJ qui ont été inoculés avec la souche de la requête.
    Remarque : Les cellules en glycérol perdent leur viabilité après plusieurs cycles de gel-dégel. Les souches de la bibliothèque de retour vers le stockage à long terme (congélateur à-80 ° C) dès que possible gardera la bibliothèque de bonne qualité et prêt pour une utilisation future. Bien entretenu, le stock de glycérol peut être congelé et décongelé au moins 10 fois. Nous recommandons également garder une copie de travail et des copies de sauvegarde de l’encours de glycérol. Lorsque le stock de travail ne fonctionne pas, immédiatement faire une nouvelle copie de travail de la copie de sauvegarde.
  8. Incuber les plaques de la DPJ à 30 ° C pendant 24 h. Note qu’une pastille de levure sera visible dans le fond de chaque puits après 24h.
  9. Plaques de remplissage 96 puits avec un support minimal d’abandon contenant 2 % raffinose, correspondant aux marqueurs sélectionnables sur le plasmide dans la souche de la requête ainsi que sur le plasmide de bibliothèque (par exemple, ici Ura - son-).
  10. Un réplicateur 96 broches stérile permet de transférer les levures de la DPJ accouplement des cultures à des milieux sélectifs. Incuber les plaques 96 puits à 30 ° C pendant 48 h ; uniquement les cellules qui ont jumelé de levure et diploïde formé des cellules et, donc, contiennent tous deux le plasmide de requête et le plasmide de bibliothèque sera capable de croître dans ce média. Après 2 jours, observer qu’un pellet est visible sur le fond des puits.

4. dosage de spotting

  1. Après 48 h de croissance dans les milieux sélectifs contenant du raffinose, repérer les levures sur milieu gélosé.
    1. Préparer 2 jeux de plaques de Ura-His-abandon contenant 2 % d’agar à l’aide de plaques de polystyrène clair, un galactose contenant de 2 % et l’autre contenant 2 % de glucose.
    2. Plaques de Vortex le 96 puits pendant 1 min à 1 000 tr/min, puis repérer la levure aux plaques Ura-His-abandon contenant du galactose de 2 % et 2 % d’agar (gènes FUS et bibliothèque sont induits) et des plaques de Ura-His-abandon contenant 2 % de glucose et 2 % d’agar (gènes FUS et bibliothèque réprimée) utilisant une machine robotique de détachage, par lequel la culture de chacun est bien repérée sur les géloses en quatre exemplaires (p. ex., la culture en 1 bien est repérée à 4 taches sur la gélose).
    3. Après avoir repéré, laisser les géloses sécher et ensuite les placer à l’envers dans une étuve à 30 ° C. Photographier les géloses toutes les 24 h pour enregistrer une croissance plus rapide/plus levure dont la toxicité pour la souche de requête est sauvée ou d’enregistrer une croissance plus lente et moins dont la toxicité pour la souche de requête est exacerbée. Incuber les boîtes pendant 4 jours.
      Remarque : La culture dans chaque bien peut être repérée sur plaques de gélose 1-to-1, comme indiqué dans une précédente méthode axée sur la transformation10. Cependant, le 1 à 4 taches ici (ce qui peut être configuré facilement utiliser la machine robotisée détachage) augmente de manière significative la robustesse du dosage en réduisant le nombre de faux positifs. Hits positifs sont considérés uniquement lorsque toutes les 4 colonies du même bien montrent un phénotype similaire.

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Representative Results

La protéine associée aux ALS FUS, une protéine de liaison ARN/ADN, a été étudiée précédemment dans la levure haploïde7,8. Génétique de dépistage à l’aide de la méthode axée sur la transformation découvert plusieurs gènes de la levure qui suppriment la toxicité FUS. Plus tard, l’homologue humain de l’un des gènes de la levure a été démontrée efficace à réprimer la toxicité neuronale de cellules primaire et modèle de rat de ALS13. Ici, nous utilisons le modèle même de la levure pour montrer que criblage surexpression peut être effectuée par l’accouplement aussi efficacement que par la transformation.

FUS est toxique pour les deux cellules haploïdes et diploïdes
Le modèle précédent de la levure de FUS et criblage de surexpression subséquente a été réalisé dans le fond de la cellule haploïde. Pour la méthode basée sur l’accouplement de travailler, toxicité FUS doit être démontrée dans la levure diploïde. Pour ce faire, nous avons accouplé le FUS levure modèle en w303a (type sexuel un) avec w303α transformé avec un vecteur vide (type α l’accouplement). Comme il est indiqué dans la Figure 2, bien que pas aussi forte qu’en levure haploïde, FUS toxicité est évidente chez la levure diploïde.

Gènes de répression identifiés précédemment travail chez la levure diploïde
Comme une preuve de principe pour la méthode d’accouplement, nous avons testé les cinq gènes précédemment identifiés par la méthode axée sur la transformation. L’accouplement a été utilisé pour chacun des cinq gènes introduire dans le modèle de levure haploïde de FUS (en W303a), et leur capacité à sauver la toxicité du FUS chez la levure diploïde suivante a été testée (W303a/α). Comme illustré à la Figure 3, tous les cinq gènes sauver la toxicité du FUS chez la levure diploïde, indiquant que la méthode correspondante a été efficace.

Un pilote dépistage des 940 gènes (rangés sur dix plaques de 96 puits)
Suite de protocoles décrits ci-dessus, nous avons appliqué la méthode d’accouplement à un criblage de la surexpression des 940 gènes. La figure 4 affiche une photo d’une plaque représentante. Comme il est indiqué sur le côté droit de la figure (FUS et bibliothèque de gènes exprimés), FUS était toxique pour les levures diploïdes. Le gène de la bibliothèque indiqué par le carré vert ont secouru toxicité FUS tandis que celle indiquée par la place rouge renforcée de toxicité.

Figure 1
Figure 1 : Diagramme pour le dépistage des modèles de levure de toxicité de protéine à l’aide d’accouplement. Une bibliothèque de plasmide (sous contrôle du promoteur GAL1 qui est hautement induit en présence de galactose) se transforme en une souche de levure haploïde (MATα) à l’aide d’un protocole de transformation de haut débit. Cette collection de levure, transformée par les plasmides de bibliothèque, est stockée comme un stock de glycérol à-80 ° C et est relancée lorsque nécessaire pour s’accoupler avec le modèle de levure haploïde de toxicité de la protéine (dans notre cas, une copie du FUS intégré au locus HIS3, promoteur de la GAL1 MATa). Les levures diploïdes contenant le plasmide de bibliothèque et de la protéine toxique (FUS) sont sélectionnées et repéré au glucose (gène FUS et bibliothèque « off ») et des boîtes de gélose de galactose (gène FUS et bibliothèque « sur »). La croissance de la levure a été suivie pour identifier les gènes qui sauver ou exacerbent la toxicité du FUS. Le carré vert indique un exemple d’un gène suppresseur qui sauve la toxicité FUS, et le carré rouge indique un exemple d’un gène d’enhancer qui aggrave la toxicité FUS lorsque surexprimés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : FUS est toxique pour les deux cellules haploïdes et diploïdes. Levure haploïde (w303 MATa) transformé avec pRS303Gal1-Fu ont été transformées avec un plasmide vide ou accouplés avec des levures du type sexuel opposé (w303 MATα) transformé par le même plasmide vide pour générer une souche de levure diploïdes. Ces souches de levures ainsi que d’une souche témoin ont alors 5 x en série dilué (de gauche à droite) et tacheté aux milieu Ura-His-Glucose (expression de gauche, FUS réprimé) et moyennes de Ura-His-Galactose (à droite, l’expression FUS induite). La photo a été prise après 2 jours de croissance à 30 ° C. Croissance presque identique de la souche de contrôle haploïdes et diploïdes a été observée, alors que la souche de contrôle haploïde a été montrée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 3
Figure 3 : Toxicité FUS de sauvetage de cinq gènes de la levure (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1et VHR1) par le biais de la méthode d’accouplement. Plasmides contenant des gènes de la levure préalablement identifiés qui suppriment la toxicité FUS ont été transformées en une souche de levure haploïde (w303 MATα). Ces levures ont été ensuite accouplés avec levure haploïde du type sexuel opposé (w303 MATa) transformé avec un plasmide d’expression FUS. Levure diploïde contenant FUS et soit un vecteur vide ou l’un des cinq gènes suppression a été sélectionné et tacheté en réplique sur plaques de gélose contenant du glucose (gènes « off ») et le galactose (gènes « on »). (1) montre une souche de levure témoin transformée avec deux vecteurs vides. (2) montre la souche de levure diploïde FUS avec un vecteur vide où l’expression de FUS est très toxique. (3 – 7) montrent la levure diploïde exprimant FUS comme un gène de la répression qui peut sauver la toxicité FUS. Chaque numéro (1 – 7) montre deux rangées de douze identiques réplique. L’image, ce qui représente trois expériences indépendantes, a été prise après 3 jours de croissance à 30 ° C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Criblage de gènes qui sauver ou exacerber la toxicité FUS. Levure haploïde contenant FUS a été accouplé avec levure haploïde contenant les gènes de la bibliothèque. Après l’accouplement, les cellules diploïdes contenant un gène de la bibliothèque et FUS ont été sélectionnés et puis repérés au glucose (gènes FUS et bibliothèque « off ») et galactose des boîtes de gélose (gènes FUS et bibliothèque « sur ») en quatre exemplaires. Sur la plaque de galactose, qui FUS et le gène de la bibliothèque ont été exprimés, la plupart des levures ne peuvent se développer bien. Cela indique que FUS est toxique et la majorité des gènes de bibliothèque n’ont pas pas sauver la toxicité. Le carré vert montre un exemple d’un gène de bibliothèque qui supprime la toxicité FUS et permet à la levure de former des colonies. Le carré rouge indique un exemple d’un gène de bibliothèque qui aggrave la toxicité FUS. Les plaques montrés ici sont représentatifs de 10 plaques de gènes de bibliothèque qui ont été projetés contre. La photo a été prise après 3 jours de croissance à 30 ° C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nous décrivons ici un protocole pour effectuer un écran de surexpression de plasmide dans la levure à l’aide de l’accouplement d’introduire de la bibliothèque de plasmide dans le modèle de la levure. En utilisant cette approche, plusieurs modèles de levure de toxicité de protéine maladies neurodégénératives peuvent projetés à l’aide de la même collection de levure transformée avec une bibliothèque de plasmide. Le laborieux processus de transformation ne doit être effectuée une seule fois, après quel levure très efficace d’accouplement est utilisé pour introduire la bibliothèque de plasmide dans la souche de la requête. Le présent Protocole s’appuie sur l’utilisation des équipements robotisés pour distribuer des médias et des cultures de levure tache sur plaques de gélose. Alors que le protocole peut être effectué sans l’aide d’équipements robotisés, il sera beaucoup plus de temps. Cette méthode a été utilisée pour le dépistage des gènes qui peuvent modifier la toxicité du FUS.

Nous avons observé que le FUS est légèrement moins toxique dans le fond de levure diploïdes. Ceci est probablement dû à nombre de copies de gènes et les différences dans les taux de croissance de levure diploïde. À moins que le phénotype qui est à l’étude est de type sexuel ou dépendant de la ploïdie, le phénotype de la croissance de la toxicité est conforme dans la levure haploïde et diploïde. Pour cette raison, la méthode d’accouplement est censée travailler largement dans de nombreux modèles de levure des différents phénotypes de croissance. Néanmoins, le phénotype du modèle levure doit être vérifié pour s’assurer qu’il est toujours présent en arrière-plan diploïde avant que cette méthode de dépistage soit effectuée. Cette méthode peut servir à étudier plusieurs phénotypes différents chez les levures et n’est pas limitée à l’étude de la toxicité des protéines neurodégénératives. En outre, des vecteurs d’expression des levures contenant de la bibliothèque plasmide peuvent être utilisés.

Après avoir effectué l’écran, il y a un certain nombre d’essais de vérification qui permettra d’assurer que les hits identifiés sont spécifiques au modèle levure projeté. Exhausteurs de toxicité doivent être testés chez la levure sans co exprimant la protéine de la maladie d’intérêt. Exhausteurs de causant la toxicité indépendante de la protéine de la maladie d’intérêt doivent être éliminés d’une analyse complémentaire. Il est important de considérer si les suppresseurs de toxicité sont affectant l’expression de la protéine de la maladie en agissant sur le promoteur Gal1. Les suppresseurs affectant l’expression du promoteur Gal1 devraient être éliminés d’une analyse complémentaire.

Les souches de levures contenant le plasmide de bibliothèque sont stockés en permanence en stock de glycérol et peuvent être rapidement repris lorsque nécessaire afin que la méthode d’accouplement peut être facilement appliquée à d’autres modèles de levure dans laquelle les mêmes gènes de bibliothèque a besoin d’être projeté contre. L’efficacité de la méthode d’accouplement devient évidente lorsque le même type de filtrage est utilisé pour éliminer les faux positifs ou lorsque plusieurs modèles de différentes levures doivent être étudiés. Nous avons utilisé avec succès cette méthode à l’écran un modèle levure de TDP-43, une autre protéine liée à l’ALS.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants pour des discussions approfondies avec les membres du laboratoire Ju et laboratoire de Zhong et le soutien financier de la Wright State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
salmon Sperm DNA (SS-DNA) Sigma-Aldrich   D1626
YPD broth Research Products International (RPI) Y20090
Granulated Agar Fisher Sci BP97445
D-(+)-Glucose Research Products International (RPI) G32040
D-(+)-Galactose Research Products International (RPI) G33000
D-(+)-Raffinose Pentahydrate Research Products International (RPI) R20500
Ammonium Sulfate Fisher Sci A702-500
Synthetic Ura- drop out medium Clontech 630416
Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil Clontech 630422
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate Research Products International (RPI) Y20060
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Sci S67496
Lithium acetate, anhydrous Fisher Sci AC268640010
Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) Spectrum Chemical  PO125-12KG
96 Pin Replicator  Scinomix SCI-5010-OS
Nunc OmniTray Thermo Sci 140156
Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid Fisher Sci 07-200-760 non-treated, sterile
Eppendorf Research plus Multichannel Pipette Eppendorf TI13690052 30-300ul volume
Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters Fisher Sci 88-860-023
Eppendorf MixMate Eppendorf 21-379-00
Eppendorf 5810R Centrifuge Fisher Sci 05-413-112
Avanti J-26 XPI Centrifuge Beckman 393127
MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser BioTek
Rotor HDA   Singer Instruments

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References

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Génétique numéro 137 levure accouplement haut débit présélection de surexpression neurodégénérescence repliement
Criblage de surexpression axée sur l’accouplement chez la levure
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Hayden, E., Chen, S., Chumley, A.,… More

Hayden, E., Chen, S., Chumley, A., Zhong, Q., Ju, S. Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast. J. Vis. Exp. (137), e57978, doi:10.3791/57978 (2018).

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