Toluidin blauer Färbung Harz eingebettet Abschnitte für die Beurteilung der Morphologie der peripheren Nerven
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die feinen Strukturen des peripheren Nerven visualisieren und 1-2 µm Abschnitte mit Toluidin blauer Färbung
Abstract
Periphere Nerven erstrecken sich im ganzen Körper, innervieren Zielgeweben mit motorischen oder sensorischen Axonen. Aufgrund der weiten Verbreitung sind periphere Nerven häufig wegen Verletzung oder Krankheit beschädigt. Methoden und Strategien entwickelt wurden, um periphere Nervenverletzung in Tiermodellen, Funktion und Regeneration, bewerten analysieren die Morphometrie der peripheren Nerven ein wesentliches Ergebnis der terminal-Messung geworden ist. Toluidin blauer Färbung des Nervs Kreuz Abschnitte gewonnenen Harz eingebettet Nerv Abschnitte ist eine reproduzierbare Methode für die qualitative und quantitative Beurteilung der peripheren Nerven, ermöglicht die Visualisierung der Morphologie Anzahl der Axone und Grad der Myelinisierung. Diese Technik kann wie bei vielen anderen histologischen Methoden schwierig sein zu erlernen und zu beherrschen, mit schriftlichen Standardprotokolle. Die Absicht dieser Veröffentlichung ist daher um schriftliche Protokolle für Toluidin blauer Färbung der peripheren Nerven mit Videografie von der Methode, bei der Ischias Nerven geerntet von Ratten zu betonen. In diesem Protokoll beschreiben wir in Vivo peripheren Nerven Fixierung und Sammlung der Gewebe und Post-Fixierung mit 2 % Osmium ausgefällt, Einbettung von Nerven in Epoxidharz und regungsloses Nerven 1-2μm Dicke schneiden. Nerv Abschnitte dann auf einen Objektträger übertragen und gefärbt mit Toluidin blau, woraufhin sie quantitativ und qualitativ bewertet werden. Beispiele für die häufigsten Probleme sind sowie Schritte zur Eindämmung dieser Probleme angezeigt.
Introduction
Periphere Nerven erstrecken sich im ganzen Körper, innervieren Zielgeweben mit motorischen oder sensorischen Axonen1. Periphere Nerven Mängel verursacht durch Erkrankungen und Trauma eine große Gesundheitsproblem darstellen und haben große wirtschaftliche Auswirkungen2,3. Trotz der Fortschritte bei der Bewertung der Ergebnisse der peripheren Nervenverletzungen und Verständnis Nervenregeneration sind traditionelle Methoden wie Nerven Histologie und Färbetechniken wesentliche Instrumente, um qualitativ und quantitativ Nerven Gesundheit bewerten als terminal Ausgang Maß in Tiermodellen oder ausgeschnittenen menschliches Gewebe. Dies ist oft mit elektrophysiologische Messungen der peripheren Nervenfunktion, gepaart wo Morphometrie offenbaren kann, warum funktionelle Nervenregeneration habe oder nicht auftreten.
Toluidin blauer Färbung der Harz eingebettet Semi-dünne periphere Nerven Abschnitte ist eine spezielle Methode für imaging Markhaltige Nervenfasern, qualitativ hochwertige und klare detaillierte Bilder von Nerv Strukturen4,5,6 . Toluidin blau ist ein acidophilen metachromatic Fleck, von William Henry Perkin im Jahre 18567, entdeckt und wurde in mehreren medizinischen Anwendungen8verwendet. Toluidin blau gefärbten peripheren Nerven Abschnitte gewonnenen Harz eingebettet Nerv Segmenten ermöglicht eine übersichtliche Visualisierung von Nervenstrukturen. Visualisierung der Myelinscheide Struktur kann durch die Verwendung von Osmium ausgefällt Post-Fixierung4,9verbessert werden. Osmium ausgefällt ist eine toxische Oxidationsmittel und Lipid Fixativ Agent, die Interaktion mit den Doppelbindungen in Lipiden, was zu krass definierten lipidreichen Myelinscheiden10. Jedoch Osmium ausgefällt ist giftig, teuer, erfordert eine längere Inkubationszeit der Nerv Segmenten und wird nicht immer verwendet.
Zur Visualisierung der peripheren Nerven Morphologie wurden alternative Methoden der Verarbeitung und Färbung entwickelt; Paraffin, Kryo-Schnitt und Epoxy-Harz eingebettet Nerv Schnitt gefolgt von Färbungen mit Toluidin blau oder Phenylendiamin Lösung verwendet wurde, um morphologische Veränderungen der peripheren Nerven Regeneration 11,12 zu quantifizieren . Jede dieser Methoden haben ihre vor- und Ertragsdaten wesentlich von der Anzahl der Axone, Myelin Dicke, Axon Durchmesser und Axon Durchmesser Markhaltige Faser Durchmesser (g-Wert) 11,13,14,15 .
Der primäre Unterschied der Harz-Einbettung in diesem Protokoll ist, dass es 1-2 μm Dicke Querschnitte aufgrund der Härte des Harzes erleichtert unter Beibehaltung der histologischen Eigenschaften des Nervs zu erhalten. Diese dünne Abschnitte, im Gegensatz zu den 4-5 μm Dicke Abschnitte von Paraffin einbetten, erhalten bieten peripheren Nerven Abschnitte mit höherer Auflösung, so dass für eine genaue Quantifizierung der Axon Myelinisierung, wie der g-Wert, die nicht aus dickeren Abschnitte16gewonnen. Während Kryo-Schnitt verwendet werden kann um 1-2 µm Abschnitte zu erhalten, ist es unserer Erfahrung gewesen, ist es schwieriger, ohne zahlreiche große Risse zu bekommen. Solche Risse Abschnitte kann ungenau zählen die Anzahl der Axone und Aspekte der Myelinisierung.
Neben Toluidin Blau Färbung17eine silberne Färbung Methode18 und Masson trichrome Färbung4 auch einsetzbar, Nervenzellen Axone zu zeigen. Jedoch gebeizt mit Harz Einbettung der Ratte n. medianus Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin oder Masson trichrome zeigte schwache Myelinscheiden und unbekannte Strukturen, während Toluidin blauer Färbung klar Myelinscheide Bild zeigte und kann leicht quantifizierte4sein. Trotz einiger Einschränkungen Toluidin blauer Färbung Harz eingebettet peripheren Nerven ist eine wertvolle Technik, die verwendet werden kann, wenn Bilder mit hoher Auflösung der Nerv Morphologie erforderlich sind.
Der primäre Nachteil für die Einbettung von Harz ist, dass es zeitaufwendig ist und nicht für Immunostaining des gleichen Gewebes aufgrund der Schwierigkeiten der Antigen-Retrieval gegenüber Paraffin und eingebettete Gefrierschnitte Techniken zu ermöglichen. So kann es nicht im Allgemeinen das gleiche Gewebe für Immunostaining zu nutzen, die über Harz-Einbettung für Toluidin blauer Färbung verarbeitet wird. Obwohl nicht verwendet hier ggf. Immunohistochemistry im Harz eingebettete Abschnitte, die Verwendung von Glykol Methacrylat Einbettung Harze ermöglicht Immunohistochemistry Gewebeschnitte ausgeführt werden, aber es ist relativ teuer19. Dies kann etwas gemildert durch Einschneiden der peripheren Nervs, separate Segmente, einige für die Einbettung von Harz und andere für Immunostaining direkt nach der Fixierung.
Der Prozess der Toluidin blauer Färbung Harz eingebettet periphere Nerven, wie mit die meisten histopathologische Analyse in fünf Stufen, einschließlich Fixierung, Austrocknung, einbetten, schneiden und färben20unterteilt werden kann. Hier wollen wir ein Protokoll und einen praktischen Leitfaden für die Verwendung von Harz eingebettete Ratte Ischiasnerv Abschnitte gebeizt mit Toluidin blau erwerben Bilder in hoher Qualität bieten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Untersuchungen der morphologischen Strukturen der periphere Nervenverletzung und Regeneration sind häufige Themen der Studie13. In diesem Protokoll beschreiben wir die Schritte, um Bilder in hoher Qualität für histologische Daten Quantifizierungen mit Ratte Ischias-Nervengewebe eingebettet in Harz Blöcken und gefärbt mit Toluidin blau zu erhalten. Diese Technik bietet ein Bild der Nerv Morphologie der Nervenregeneration durch Messung der Zahl von Axonen, Grad der Myelinisierung, Vorhandensein…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Thankthe Jenkins-Mikroskopie-Anlage an der University of Wyoming für ihre Hilfe und die Mitglieder des Bushman Lab, Kelly Roballo, Hayden wahr, Wupu Osimanjiang und Subash Dhunghana, um Unterstützung bei der Pflege der Tiere. Diese Publikation wurde durch eine institutionelle Development Award (IDeA) aus dem National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Grant # 2P20GM103432 ermöglicht.
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
References
- Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us. Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).
- Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).
- Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair. Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).
- Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation. Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach. Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).
- Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).
- Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. Toluidine blue and Lugol’s iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).
- Dykstra, M. J. . A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , 257 (1993).
- Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
- Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve. Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).
- Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode. Brain research. , 65-77 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques. International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).
- Bozkurt, A., Lassner, F., O’Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).
- Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists. Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).
- Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration. Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).
- Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve. Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).
- Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections. Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).
- Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: A literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).
- Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety. Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).
- Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).
