Azul de toluidina tinción de secciones embebido en resina para la evaluación de la morfología del nervio periférico
Summary
Aquí presentamos un protocolo para visualizar estructuras finas de los nervios periféricos de obtención y tinción de secciones de 1-2 μm con toluidina azul
Abstract
Los nervios periféricos se extienden por todo el cuerpo, inervan los tejidos diana con axones motores o sensoriales. Debido a la amplia distribución, los nervios periféricos con frecuencia se dañan debido a trauma o enfermedad. Métodos y estrategias se han desarrollado para evaluar lesiones de nervios periféricos en modelos animales, la función y regeneración, análisis de la morfometría de los nervios periféricos se ha convertido en una medida esencial resultado terminal. La coloración del nervio Cruz azul de la toluidina secciones de secciones de resina incrustada del nervio es un método reproducible para la evaluación cualitativa y cuantitativa de los nervios periféricos, lo que permite la visualización del número de axones de morfología y grado de myelination. Esta técnica, como con muchos otros métodos histológicos, puede ser difícil de aprender y dominar mediante protocolos estándar escritos. La intención de esta publicación es por lo tanto acentúan protocolos escritos para la coloración de los nervios periféricos con videografía del método, con los nervios ciático de ratas azul de toluidina. En este protocolo se describe en vivo fijación del nervio periférico y colección del tejido y la fijación con tetróxido de osmio 2%, incrustación de nervios en la resina de epoxy y ultramicrótomo secciones de nervios a 1-2 μm de espesor. Secciones del nervio luego transfirieron a un portaobjetos de vidrio y teñidas con azul de toluidina, después de lo cual ellos son cuantitativa y cualitativamente evaluados. Se muestran ejemplos de los problemas más comunes, así como medidas para mitigar estos problemas.
Introduction
Los nervios periféricos se extienden por todo el cuerpo, inervan los tejidos diana con axones motores o sensoriales1. Defectos de los nervios periféricos causaron por trastornos y traumas representan un problema de salud pública importante y tiene grandes repercusiones económicas2,3. A pesar de los avances en la evaluación de los resultados de las lesiones de nervio periférico y la comprensión de la regeneración del nervio, los métodos tradicionales tales como nervio histología y técnicas de tinción son herramientas esenciales evaluar cualitativa y cuantitativamente la salud del nervio como una medida de resultado terminal en modelos animales o tejido humano suprimido. Esto a menudo es acompañado de medidas electrofisiológicas de la función de nervio periférico, donde morfometría puede revelar por qué regeneración nerviosa funcional hizo o no ocurrió.
Azul de toluidina tinción de secciones semi-delgadas periférica del nervio de resina incrustada es un método especializado de fibras de nervio myelinated, proporcionando la alta calidad de imagen y detalladas imágenes claras del nervio estructuras4,5,6 . Azul de toluidina es una tinción metacromática acidófilas, descubierta por William Henry Perkin en7de 1856 y ha sido utilizado en varias aplicaciones médicas8. Secciones de nervio periférico teñido de azul de toluidina de segmentos nerviosos embebido en resina permite la clara visualización de las estructuras nerviosas. Visualización de la estructura de la vaina de mielina puede ser mejorado por el uso de tetróxido de osmio posteriores a la fijación4,9. Tetróxido de osmio es un oxidante y los lípidos fijador agente tóxico que interactúa con los enlaces dobles en lípidos, resultando claramente definidas las envolturas de myelin ricos en lípidos10. Sin embargo, tetraóxido de osmio es tóxico, caro, requiere una incubación más larga de segmentos nerviosos y no se utiliza siempre.
Se han desarrollado métodos alternativos de procesamiento y tinción para visualización de la morfología del nervio periférico; Parafina, secciones criogénico y seccionamiento de nervio embebido en resina epoxi seguida de tinción con azul de toluidina o solución fenilenodiamina se ha utilizado para cuantificar los cambios morfológicos de la regeneración del nervio periférico 11,12 . Cada uno de estos métodos tienen sus ventajas y rendimiento de datos esenciales sobre el número de axones, mielina grosor, diámetro de axón y diámetro del axon myelinated fibra diámetro (cociente de g) 11,13,14,15 .
La principal distinción de la incrustación de resina en este protocolo es que facilita la obtención de secciones transversales de espesor de 1-2 μm debido a la dureza de la resina mientras que mantiene las cualidades histológicas del nervio. Estas secciones finas, en comparación con el 4-5 μm espesor secciones de parafina inclusión, proporcionan secciones periféricas del nervio con mayor resolución, lo que permite una cuantificación más precisa de la mielinización del axón, como la relación de g, que no puede ser obtenidos de las secciones más gruesas16. Mientras que la sección criogénica puede utilizarse para obtener secciones de 1-2 μm, ha sido nuestra experiencia que es más difícil obtener secciones sin numerosas fisuras grandes. Dichas secciones agrietadas pueden causar conteo inexacto del número de axones y aspectos del myelination.
Además de azul de toluidina17la coloración, una tinción método18 y tinción tricrómica de Masson4 de plata también puede utilizarse para demostrar axones nerviosos. Sin embargo, utilizando resina, incrustación de secciones del nervio mediano de rata teñido con hematoxilina y eosina o Masson trichrome mostró débil las envolturas de myelin y estructuras desconocidas, considerando que la tinción de azul de toluidina demostró imagen clara de la mielina y puede fácilmente ser cuantificados4. A pesar de algunas limitaciones, los nervios de toluidina azul de resina incrustada la coloración periférica es una técnica valiosa que puede utilizarse cuando se necesitan imágenes de alta resolución de la morfología del nervio.
La principal desventaja para la incrustación de resina es que consume mucho tiempo y no permite el immunostaining del tejido del mismo debido a la dificultad de recuperación de antígeno en comparación con la parafina y las secciones congeladas incrustado técnicas. Por lo tanto, no es generalmente posible utilizar el mismo tejido para la inmunotinción que se procesa mediante incrustación de resina para la tinción de azul de toluidina. Aunque no utilizado aquí, si se desea immunohistochemistry en resina secciones embebidas, el uso de metacrilato de glicol incorporar resinas permite immunohistochemistry ser realizadas en las secciones de tejido, pero es relativamente caro19. Esto puede mitigarse un poco cortando el nervio periférico en segmentos, algunos para incrustación de resina y otros para la inmunotinción directamente después de la fijación.
El proceso de tinción de toluidina azul de resina incrustados los nervios periféricos, como con el análisis histopatológico más, puede dividirse en cinco etapas, incluyendo fijación, deshidratación, inclusión, seccionamiento y tinción20. Aquí pretendemos proporcionar un protocolo y guía práctica para el uso de las secciones de nervio ciático de rata incrustado manchadas de resina con imágenes de alta calidad para la adquisición de azul de toluidina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Exámenes de las estructuras morfológicas de la lesión periférica del nervio y regeneración son frecuentes temas de estudio13. En este protocolo, describimos los pasos para obtener imágenes de alta calidad para cuantificaciones de datos histológicos utilizando tejido de nervio ciático de rata incrustados en bloques de resina y teñidas con azul de toluidina. Esta técnica proporciona una imagen de la morfología del nervio en el que la regeneración del nervio puede ser cuantificada midiend…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean a thankthe instalaciones de microscopía de Jenkins en la Universidad de Wyoming por su ayuda y los miembros del laboratorio de bosquimano, Kelly Roballo, verdadera de Hayden, Wupu Osimanjiang y Subash Dhunghana, para la asistencia en el cuidado de los animales. Esta publicación ha sido posible por una concesión de desarrollo institucional (IDeA) desde el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud, bajo la subvención # 2P20GM103432.
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
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