Toluidin Blue reçine gömülü bölümlerini periferik sinirleri morfoloji değerlendirme için boyama
Summary
Burada güzel yapıları periferik sinir alma ve 1-2 µm bölümlerle toluidin blue boyama görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut
Abstract
Periferik sinirler hedef dokulara motor ya da duyusal aksonlar ile innerve vücut boyunca uzanır. Yaygın dağıtım nedeniyle periferik sinirler sık travma veya hastalık nedeniyle zarar görmüş. Periferik sinir yaralanma hayvan modellerinde, işlev ve rejenerasyon, değerlendirmek için geliştirilmiştir yöntemleri ve stratejileri gibi periferik sinirleri morfometri analiz bir temel terminal sonuç ölçü haline gelmiştir. Toluidin sinir çapraz boyama Mavi bölümler gömülü reçine sinir bölümlerden elde edilen nitel ve nicel değerlendirmeler periferik sinir, görselleştirme akson sayısı Morfoloji ve derecesi etkinleştirme için tekrarlanabilir bir yöntemdir myelination. Bu teknik yöntemlerle birçok diğer histolojik olarak öğrenmek ve standart yazılı protokolleri kullanarak master zor olabilir. Bu yayının amacı bu nedenle toluidin videografisi siyatik sinirleri sıçanlarından emir hasat kullanarak yöntemi ile periferik sinirleri boyama mavi yazılı protokollerde vurgulamak için. Bu protokol için in vivo periferik sinirleri fiksasyon ve doku ve sonrası fiksasyon ile % 2 osmiyum tetroxide, topluluğu tarif epoksi reçine ve ultramicrotome sinir için 1-2μm kalınlık kesit sinirleri katıştırma. Sinir bölümleri bir cam slayt transfer ve sonra onlar nicelik ve nitelik değerlendirilir toluidin blue ile lekeli. En sık görülen sorunlar örnekleri yanı sıra bu sorunları azaltıcı adımlar gösterilmiştir.
Introduction
Periferik sinirler hedef dokulara motor ya da duyusal aksonlar1ile innerve vücut boyunca uzanır. Tarafından tıbbi bozukluklar periferik sinirleri hataları neden ve travma büyük kamu sağlık kaygı temsil ve büyük ekonomik etkileri2,3. Periferik sinir yaralanmaları sonuçlarını değerlendirmek ve sinir rejenerasyon anlama gelişmeler rağmen sinir Histoloji ve teknikleri boyama gibi geleneksel yöntemleri nitelik ve nicelik sinir sağlık değerlendirmek için gerekli araçları vardır. bir terminal sonucu ölçüyü hayvan modelleri veya eksize insan dokusu. Bu kez neden işlevsel sinir rejenerasyon mi ya da olmamış nerede morfometri ortaya çıkarabilir periferik sinir fonksiyonu, elektrofizyolojik ölçümleri ile eşleştirilmiş olan.
Toluidin blue gömülü reçine periferik sinirleri yarı ince bölümlerini boyama myelinated sinir lifleri, yüksek kalite sağlayan görüntüleme için özel bir yöntemdir ve sinir yapıları4,5,6 detaylı görüntülerini temizlemek . Toluidin blue 18567‘ de, William Henry Perkin tarafından keşfedilen bir acidophilic metakromatik leke ve çeşitli tıbbi uygulamalar8‘ kullanılır. Toluidin periferik sinirleri mavi lekeli bölümleri reçine gömülü sinir kesimleri elde sinir yapıları net görselleştirme için sağlar. Görselleştirme miyelin kılıf yapısının osmiyum tetroxide sonrası fiksasyon4,9kullanımı ile gelişmiş olabilir. Osmiyum tetroxide starkly tanımlanmış lipid zengini miyelin kılıf10dakika sonra sonuçlanan lipidler, Çift bonolarını ile etkileşimde bulunan bir toksik oksidan ve lipid sabitleştirici ajandır. Ancak, osmiyum tetroxide toksik, pahalı, sinir segmentlerinin uzun bir kuluçka için ve her zaman kullanılmaz.
İşleme ve boyama alternatif yöntemler periferik sinirleri morfoloji görselleştirme için geliştirilmiştir; Boya çözüm periferik sinirleri rejenerasyon 11,12 morfolojik değişiklikleri ölçmek için kullanılan veya parafin, kriyojenik kesit ve epoksi reçine gömülü sinir kesit toluidin blue ile boyama tarafından takip . Bu yöntemler her aksonlar, miyelin kalınlığı, akson çapı ve akson çapı myelinated lif çapı (g-oran) 11,13,14,15 sayısı avantaj ve verim temel veri var .
Birincil reçine-bu iletişim kuralı içinde katıştırma o sinir histolojik özellikleri korunarak reçine sertliği nedeniyle 1-2 mikron kalınlık kesit alma kolaylaştırır ayrımdır. Bu ince kesitler, gömme, parafin elde 4-5 mikron kalınlığı bölümleri aksine periferik sinir bölümlerde axon myelination, g-oranı, olamaz gibi daha doğru bir miktar için izin veren yüksek çözünürlüklü daha kalın kesitler16‘ dan elde. Kriyojenik kesit 1-2 µm bölümler elde etmek için kullanılan iken, bizim deneyim daha bölümlerde çok sayıda büyük çatlak olmadan elde etmek zor oldu. Kırık tür bölümleri akson sayısı ve myelination yönleri yanlış sayım neden olabilir.
Toluidin blue yanı sıra17boyama yöntemi18 ve Masson’ın trichrome boyama4 boyama bir gümüş de sinir aksonlar göstermek için kullanılabilir. Oysa toluidin blue boyama açık miyelin kılıf görüntü gösterdi ve -ebilmek kolayca Ancak, reçine sıçan medyan sinir bölümlerini katıştırma kullanarak ya Hematoksilen ve eozin veya Masson’ın trichrome gösterdi zayıf miyelin kılıf ve tanınmayan yapıları ile lekeli quantified4yaşında. Bazı sınırlamaları rağmen toluidin gömülü reçine periferik boyama mavi sinir sinir morfolojisi yüksek çözünürlüklü görüntüleri gerekli olduğunda kullanılabilecek değerli bir teknik var.
Reçine katıştırma için birincil dezavantajı bu zaman alan ve parafin ve donmuş gömülü bölümleri teknikleri ile karşılaştırıldığında antijen alma zorluğu nedeniyle aynı doku immunostaining için izin vermez olduğunu. Bu nedenle, reçine-toluidin blue boyama için katıştırma üzerinden işlenir immunostaining için aynı doku kullanmak genellikle mümkün değildir. Her ne kadar değil immünhistokimya isteniyorsa burada, kullanılan reçine katıştırılmış kesitler, glikol metakrilat reçineleri katıştırma kullanımı verir için doku bölümler üzerinde gerçekleştirilecek immünhistokimya; nispeten pahalı19yaşında Bu biraz periferik sinirleri ayrı kesimleri, bazı reçine katıştırma için ve diğerleri için immunostaining içine doğrudan fiksasyon sonra kesim tarafından azaltılabilir.
Toluidin blue reçine boyama işlemi en histopatolojik analizi ile fiksasyon, su kaybı da dahil olmak üzere, gömme, kesit ve20boyama beş aşamada bölünmüştür gibi periferik sinirler, katıştırılmış. Biz burada katıştırılmış sıçan siyatik sinir bölümleri lekeli reçine toluidin elde etmek için mavi yüksek kaliteli görüntüler ile kullanmak için bir iletişim kuralı ve pratik kılavuz sağlamayı amaçlamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Periferik sinir hasarı ve rejenerasyon morfolojik yapılarının imtihanlarını çalışma13sık konularıdır. Bu protokol için reçine bloklar halinde gömülü ve toluidin blue ile lekeli sıçan siyatik sinir dokusu kullanarak histolojik veri quantifications için yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için gereken adımları açıklar. Bu tekniğin sinir morfoloji içinde sinir rejenerasyon akson sayısı, myelination, infiltrative fibrotik doku varlığı ve sağlığı sinirler ölç…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar naklinden Jenkins mikroskobu tesisinde Wyoming Üniversitesi için onların yardım ve üyeleri Bushmen lab, Kelly Roballo, Hayden doğru Wupu Osimanjiang ve harun Dhunghana, hayvan bakımı yardım için istiyorum. Bu yayın bir Kurumsal Geliştirme Ödülü (fikir) üzerinden ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant # 2P20GM103432 altında mümkün yapıldı.
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
References
- Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us. Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).
- Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).
- Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair. Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).
- Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation. Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach. Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).
- Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).
- Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. Toluidine blue and Lugol’s iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy. Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).
- Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).
- Dykstra, M. J. . A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , 257 (1993).
- Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
- Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve. Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).
- Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode. Brain research. , 65-77 (2008).
- Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques. International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).
- Bozkurt, A., Lassner, F., O’Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves. Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).
- Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists. Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).
- Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration. Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).
- Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve. Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).
- Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections. Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).
- Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: A literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).
- Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety. Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).
- Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).
