톨루이 블루 주변 신경 형태학의 평가 대 한 수 지에 포함 된 섹션의 얼룩
Summary
여기에 우리가 현재 고 1-2 µ m 섹션 톨루이 블루 얼룩으로 주변 신경의 미세 구조를 시각화 하는 프로토콜
Abstract
주변 신경와 모터 또는 감각 축 삭 대상 조직 innervating 몸 전체 확장. 때문에 광범위 한 분포, 주변 신경은 자주 외상 또는 질병으로 인해 손상 됩니다. 방법 및 전략 주변 신경 손상 동물 모델, 기능 및 재생, 평가 하기 위해 개발 된 주변 신경의 morphometry 분석 되고있다 필수적인 터미널 결과 측정. 톨루이 블루 얼룩 신경의 크로스 섹션 포함 수 지 신경 섹션에서 얻은 주변 신경, 시각화 형태학 축 삭의 수와의 사용의 질적 및 양적 평가 대 한 재현 방법 myelination입니다. 이 기술은 다른 많은 조직학 방법, 것과 같이 어려울 수 있습니다 학습과 표준 작성 된 프로토콜을 사용 하 여 마스터. 이 간행물의 의도 톨루이 블루 videography 메서드를 사용 하 여 쥐에서 수확 하는 좌 골 신경의와 주변 신경의 얼룩에 대 한 서 면된 프로토콜을 강조 하 그러므로 이다. 이 프로토콜에서 우리 주변 신경 기정 vivo에서 그리고의 조직, 그리고 2% 오스뮴 tetroxide와 후 고정 컬렉션 설명 에폭시 수 지, 그리고 ultramicrotome 신경 1-2 μ m 두께 단면에서 신경의 포함. 신경 섹션 다음 유리 슬라이드에 전송 하 고 후 그들은 양적 및 질적 평가 톨루이 파란색으로 물. 예는 가장 일반적인 문제는 이러한 문제를 완화 하기 위해 단계 뿐만 아니라 표시 됩니다.
Introduction
주변 신경 모터 또는 감각 축 삭1대상 조직 innervating 몸 전체 확장. 의료 장애로 인 한 말 초 신경 결함 외상 중요 한 공중 위생 관심사를 대표 하 고 큰 경제적 파급 효과2,3. 주변 신경 상해의 결과 평가 하 고 신경 재생을 이해에 있는 전진에도 불구 하 고 전통적인 방법 신경 조직학 등 기법을 얼룩이 지는 질적 및 양적 평가 신경 건강에 필수적인 도구 으로 동물 모델 또는 삭제 인간의 조직에 터미널 결과 측정. 이것은 종종 morphometry 기능 신경 재생 않았거나 발생 하지 않은 이유를 밝힐 수 있다 주변 신경 기능의 electrophysiological 측정와 결합 됩니다.
톨루이 블루 이미징 myelinated 신경 섬유, 높은 품질을 제공 하는 전문적인 방법 포함 수 지 주변 신경 반 얇은 섹션의 얼룩이 지 고 신경 구조4,5,6의 상세한 이미지를 지우기 . 톨루이 블루 acidophilic metachromatic 얼룩, 18567, 윌리엄 헨리 Perkin에 의해 발견 이며 여러 의료 응용 프로그램8에서 사용 되었습니다. 톨루이 블루 스테인드 주변 신경 섹션 수 지 포함 신경 세그먼트에서 얻은 신경 구조의 명확한 시각화 수 있습니다. Myelin 칼 집 구조 시각화 오스뮴 tetroxide 후 고정4,9를 사용 하 여 향상 될 수 있습니다. 오스뮴 tetroxide은 독성 산화 제와 지질 통 에이전트 지질에 이중 결합 상호 작용 starkly 정의 된 지질이 풍부한 myelin 칼 집10인. 그러나, 오스뮴 tetroxide 독성, 비싼, 더 이상 외피 신경 세그먼트의 필요 이며 항상 사용 되지 않습니다.
주변 신경 형태학;의 시각화에 대 한 처리 및 얼룩의 대체 방법은 개발 되었다 파라핀, 극저온 단면, 에폭시 수 지에 포함 된 신경 단면 다음 톨루이 파랑 얼룩 또는 phenylenediamine 솔루션 주변 신경 재생 11,12의 형태학 적 변화를 측정 하는 데 사용 되었습니다. . 이러한 각 메서드는 그들의 이점 및 수율 필수 데이터 축 삭, 수 초 두께, 축 삭 직경 및 myelinated 섬유 직경 (g 비율) 11,,1314,15 축 삭 직경의 수에 .
수 지 포함이 프로토콜의 기본 구분은 그것 신경의 조직학 품질을 유지 하면서 1-2 μ m 두께 횡단면 때문에 수 지의 경도 얻기 용이 합니다. 이러한 얇은 섹션 포함, 파라핀에서 얻은 4-5 μ m 두께 섹션 반대로 주변 신경 축 삭 myelination, g-비율, 수 없는 등의 보다 정확한 정량화에 대 한 높은 해상도 섹션 제공 두꺼운 섹션16에서 얻은. 극저온 단면 1-2 µ m 섹션을 얻기 위해 사용할 수 있는, 그것은 우리의 경험 그것은 수많은 큰 균열 없이 섹션을 얻기 위해 더 어려운 되었습니다. 같은 금이 섹션 축 삭의 수 및 myelination의 측면의 부정확 한 계산을 발생할 수 있습니다.
톨루이 블루17얼룩, 뿐만 아니라 방법18 과 Masson의 trichrome 얼룩4 얼룩은 또한 신경 축 삭 표시를 사용할 수 있습니다. 그러나 반면 톨루이 블루 얼룩 지우기 myelin 칼 집 이미지 그리고 쉽게 중 되며 오신 또는 Masson의 trichrome 보였다 희미 한 myelin 칼 집 및 인식할 수 없는 구조, 스테인드 수 지 쥐 중간 신경 섹션의 포함을 사용 하 여 정량된4수 있습니다. 몇 가지 한계에도 불구 하 고 톨루이 블루 얼룩 포함 된 수 지의 주변 신경 신경 형태학의 고해상도 이미지는 필요한 경우 사용할 수 있는 유용한 기술입니다.
수 지를 포함에 대 한 주요 단점은 그것은 시간이 많이 걸리는 이며 파라핀 및 냉동된 임베디드 섹션 기술에 비해 항 원 복구의 어려움으로 인해 같은 조직의 immunostaining에 대 한 허용 하지 않습니다. 따라서, 일반적으로 수 지-톨루이 블루 얼룩에 대 한 포함을 통해 처리 되는 immunostaining에 대 한 동일한 조직 활용 수 아니다. 비록 하지 immunohistochemistry 바란다면 여기, 사용 수 지에 포함 된 섹션, 글리콜 메타 크 릴 산 수 지를 포함의 사용 허용 immunohistochemistry 조직 섹션에서 수행할 수 있지만 그것은 상대적으로 비싼19. 이 고정 후 직접 별도 세그먼트, 수 지를 포함에 대 한 일부 및 immunostaining에 대 한 다른 사람으로 말 초 신경 절단 하 여 다소 완화 될 수 있습니다.
톨루이 블루 수 지 얼룩이 지기의 과정으로 가장 histopathological 분석, 나눌 수 있습니다 5 단계, 고정, 탈수를 포함 하 여, 포함, 단면, 그리고20얼룩으로 주변 신경, 임베디드. 우리 하고자 여기 톨루이 얻으려고 블루 높은 품질의 이미지와 함께 포함 된 쥐 좌 골 신경 섹션 스테인드 수 지를 사용 하기 위한 프로토콜 및 실용적인 지침을 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
주변 신경 손상 및 재생의 형태학 적 구조 시험 연구13의 빈번한 주제는. 이 프로토콜에서 우리 조직학 데이터 quantifications 쥐 좌 골 신경 조직 수 지 블록에 포함 된 및 톨루이 파랑 스테인드를 사용 하 여에 대 한 높은 품질의 이미지를 얻을 수 있는 단계를 설명 합니다. 이 기술은 신경 형태학 축 삭의 수, myelination, infiltrative 거리 조직의 존재와 건강 신경의 정도 측정 하 여 신경 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 thankthe 젠킨스 현미경 시설 그들의 도움과 멤버 Bushman 실험실의 켈리 Roballo, 헤이든 진정한, Wupu Osimanjiang, Subash Dhunghana, 동물 보호에 대 한 와이오밍 대학에서 하 고 싶습니다. 이 게시가 되었습니다 기관 개발 상 수상 (IDeA는)에 의해 국립 과학 연구소에서의 일반 의료의 부여 # 2P20GM103432에서 건강의 국가 학회.
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline | Gibco | 14200-075 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Acros Organics | 205950010 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-013-25 | |
| Epoxy Embedding Medium Kit | Sigma-Aldrich | 45359 | |
| Sodium Hydroxide Solution | Sigma-Aldrich | 72068 | To adjust Trump's fixative pH |
| Acetone | Fisher Chemical | 170942 | |
| Osmium Tetroxide Solution | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| VWR Micro Slides, Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545102 | |
| Pelco Embedding Cast | Fisher Scientific | NC9671811 | |
| Glass Knife Maker | RMC Products | GKM-2 | |
| Ultramicrotome | RMC Products | MT-XL | |
| 15 mL Conical Tube | Falcon | ISO 9001 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 4 mL Glass Vial | Sigma-Aldrich | 854190 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | For trimming resin block |
| Perfect Loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | For picking up thin resin sections |
| Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| 100 Watt Oven | Millipore | 6350115 | |
| Whatman Filter Paper | Sigma-Aldrich | WHA10010155 | |
| 3 mL plastic pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | |
| Micro-surgical Kit | World precision instruments | ||
| Olympus fluorescence microscope | Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80 |
References
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