TRNA イソペンテニル トランスフェラーゼ活性を検出する体外の試金
Summary
ここで、Mod5、酵母 RNA 修飾酵素の生化学的解析のためのプロトコルを記述し、このプロトコル可能性があります他の RNA 修飾酵素に適用する方法について説明。
Abstract
N6– isopentenyladenosine RNA 変更、機能的多様性と原核生物と真核生物の間で非常に節約されました。最も非常に節約された N6– isopentenyladenosine 変更の 1 つは、Trna のサブセットの A37 位置に発生します。この変更は、tRNA のリボソームの親和性を高めることによって翻訳の効率と忠実度を向上します。真核生物でこの変更に関わる酵素の突然変異は、ミトコンドリア機能障害やがんなどいくつかの病気の状態に関連付けられます。したがって、基質特異性とこれらの酵素の生化学的活性について常態と病態の真核生物の生物学の理解のために重要です。方法の多様な配列は、私6A の変更の特性評価に採用されています。ここは Mod5 によって isopentenylation の検出のための直接的なアプローチを説明します。このメソッドは、組換えイソペンテニル トランスフェラーゼ、続いて RNase T1 消化と私に6A の変更を検出する 1 二次元のゲルの電気泳動分析と Rna の孵化を利用しています。さらに、他の RNA 修飾酵素を特徴付けるこのプロトコルの潜在的な適応性を説明します。
Introduction
Rna に、コンテキストに依存する多様な機能、直接 RNA の構造に影響を与える、他の RNA の相互作用に影響を与えるこれらの変更で少なくとも 163 異なる転写後の RNA の修正も確認されています。分子1,2。番号とさまざまな RNA 編集のための感謝が増えると、RNA 修飾とそれらを触媒する酵素の両方を問い合わせること確実に試金の開発が急務です。
識別される最初の RNA 修飾の一つは、基本 37 Trna、3′ 側3,4反のコドンに隣接してに発生します。イソペンテニル グループ dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) からアデノシン 37 の N6 位置に転送されます (私6A37) 3,5細胞質とミトコンドリア Trna のサブセット。私6A37 翻訳忠実度を向上させるし、6リボソーム4,6と私の tRNA の親和性を高めることによって効率 A37 細菌7のストレス反応にとって重要です。この変更を行う酵素 tRNA イソペンテニル トランスフェラーゼと呼ばれている、非常に高い真核生物13、植物12ワーム11菌10細菌8,9で保存、人間14を含みます。
ヒト tRNA イソペンテニル トランスフェラーゼの遺伝子、 TRIT1、突然変異は人間の病気と関連付けられます。たとえば、 TRIT1の突然変異ミトコンドリアのタンパク質合成15,16の欠陥によって引き起こされる可能性が高い重大なミトコンドリア病と相関しています。さらに、 TRIT1は腫瘍のサプレッサー遺伝子17,18として記載されている、癌悪性黒色腫19、乳房20、胃21、肺癌22 などのいくつかの種類に関与しています。 ,23。最後に、TRIT1 と Mod5 (酵母) イソペンテニル トランスフェラーゼ、集計しやすいタンパク質プリオンのようなアミロイド繊維24,25,26を形成します。これの直接的な証拠は示されていないが、これらの観察は潜在的神経変性疾患における tRNA イソペンテニル トランスフェラーゼを巻き込みます。
イソペンテニル トランスフェラーゼ活性の翻訳と病気、私に6を直接測る方法イソペンテニル トランスフェラーゼが果たす役割を考えるこれらの通常の下で酵素と病気の状態の機械論的理解のために重要であります。私に肯定的な交配の in vitro isopentenylation アッセイを含む6A RNA 改変を検出するメソッド数の増加があります私の不在で6(PHA6) を試金、薄層クロマトグラフィー (TLC)、アミノ酸受け入れ活性測定法および質量分析法によるアプローチ (Ref. 4レビュー)。
14C DMAPP とラベルの Trna を利用した isopentenylationの in vitroアッセイが記載されています。このアッセイで、放射性炭素がイソペンテニル トランスフェラーゼでは14C DMAPP から RNA に転送されます。この試金は高感度が、しばしば特定の残基を変更9,20,27を判断することは困難です。PHA6 試金、かさばるに頼る私6A の変更変更後の残渣をまたがる32P 標識プローブの交配を妨げること。ですから、交配は私の不在で大きい6修正18,28,29。PHA6 試金は非常に敏感な細胞溶解液から抽出されたトータル RNA を分析する能力が。さらに、関心の RNA に固有のプローブの設計機能柔軟性をこのメソッド実質的なターゲット。ただし、PHA6 の試金はプローブの対象地域内の残留発生、新規修飾部位を特定しにくいため変更の評価に限定されます。また、バインディングの有無の変更を示すものとして他の変更または RNA 結合に影響を与える突然変異にデータ分析が混同されます。
別のアプローチは、tRNA30で6A 変更私の読み出しとしてアミノ酸受入れ活動とベンジル DEAE セルロース (BD) セルロース クロマトグラフィーを組み合わせたものです。この方法は、関数を直接試金 i の6A の変更、しかし、それは私に6A の変更を検出する間接アプローチと RNA の特定の残基への変更をマップする解像度が不足します。TLC のアプローチは、合計 tRNA を検出する使用されています私6A の変更。このアプローチで単一ヌクレオチドに32P 標識 Trna を消化する内部的、二次元 TLC 分析は、isopentenylation を識別するために使用されます。このアプローチは非常に敏感な検出、私に与えられた RNA サンプル6A を合計が、消化時にシーケンスのすべての情報が失われます。したがって、調査官はどの残基が変更された31をされているを確認する方法はありません。
最近では、液体クロマトグラフィー ・ タンデム質量分析法 (MS/LCMS) 方法開発されている定量的に比較する種、細胞の種類、および実験条件32,33、間の総 RNA の修正 34。この方法の制限が少ない派生した34の id と変更されたヌクレオシドがいたから RNA 内の位置を決定することができます。さらに、専門知識とこれらの実験を実行するために必要な機器は、このアプローチの実用性を制限します。
さらに、RNA の変更トランスクリプトーム34をマップするいくつかの次世代シーケンシング技術をしました。特定の変更 (RIP Seq) に特異抗体を免疫沈降の Rna は、特定の変更35,36を含むすべてのシーケンスを識別するために調査官を有効にします。さらに、化学 Seq など非ランダムな不一致シーケンス逆転写酵素ベースのアプローチは変更された残37,38,39逆転写反応の摂動に依存します。RNA トランスクリプトームの変更をマップするこれらの技術の利点にもかかわらず RIP seq とケム Seq 技術は信頼性の高い抗体の反応性化学物質ごとの特定の変更は、それぞれ34の不足によって制限されます。また、逆転写酵素の酵素化学 Seq を実行する、非ランダムな不一致の配列解析技術は、安定した RNA の構造によって妨げられることができます。Trna の非常に変更された、構造的に安定した性質は、それらがこれらの技術を使用して調査する特に困難にします。までに、次世代シーケンス技術は私に6の変更34をマップにまだ活用されていません。
ここで、私に6A tRNA 変更体外を検出する単純で直接的アプローチについて述べる.このメソッドは、Rna 組換え酵母イソペンテニル トランスフェラーゼ (Mod5) と続いて、RNase T1 消化と 1 二次元のゲルの電気泳動分析私の6A の変更をマップするを利用しています。この方法は直接、データの分析に少し専門知識が必要です。さらに、このメソッドは修正の酵素、RNA またはゲルによる RNA のモビリティの分子量を変更する共有結合酵素を含む他の RNA に適応されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA 修飾は、細胞・個体機能のこれまで以上に重要かつ多様な役割を果たすことに表示し続けます。など、RNA 修飾酵素を尋問するアッセイの開発は生物学の基本的な側面を理解するより良い中心です。このプロトコルでは、高解像度の in vitroアッセイで Mod5 の tRNA の修正活動の特性について説明します。
このプロトコルには、isopentenylation の直接と簡単に解釈でき?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は彼の指導と有用なコメントがこの原稿のため博士デイヴィッド Engelke を感謝したいです。PJS – ボール州立大学研究所スタートアップ資金;軽打 – 1R15AI130950-01 を付与します。
Materials
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).
- Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions. Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).
- Soll, D. Enzymatic modification of transfer RNA. Science. 173 (3994), 293-299 (1971).
- Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA. RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).
- Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA. Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).
- Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications. EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).
- Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation. RNA. 22 (5), 729-742 (2016).
- Caillet, J., Droogmans, L. Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA. Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop. Biochimie. 39 (21), 6546-6553 (2000).
- Dihanich, M. E., et al. Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).
- Lemieux, J., et al. Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria. Génétique. 159 (1), 147-157 (2001).
- Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).
- Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells. Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).
- Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase. Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).
- Kernohan, K. D., et al. Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene. Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).
- Yarham, J. W., et al. Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA. PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).
- Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer. Gene. 556 (1), 13-18 (2015).
- Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).
- Swoboda, R. K., et al. Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3′ untranslated region of TRIT1. Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).
- Yue, Z., et al. Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information. Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).
- Chen, S., et al. Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population. Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).
- Spinola, M., et al. Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer. Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).
- Spinola, M., et al. Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients’ survival. Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).
- Read, D. F., et al. Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing. FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).
- Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro. Gene. 612, 19-24 (2017).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues. Biochimie. 40 (6), 1734-1740 (2001).
- Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases. Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).
- Lamichhane, T. N., et al. Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).
- Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).
- Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence. Cell. 18 (1), 11-26 (1979).
- Yan, M., et al. A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes. Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).
- Su, D., et al. Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry. Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Dominissini, D., et al. The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
- Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3′ UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Schwartz, S., et al. Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA. Cell. 159 (1), 148-162 (2014).
- Schwartz, S., et al. High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis. Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).
- Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA. Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).
- Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tackling structures of long noncoding RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).
