In Vitro Assay для обнаружения деятельности трансферазы tRNA изопентенил
Summary
Здесь мы описываем протокол для биохимических характеристик РНК изменение фермента дрожжей, Mod5 и обсудить, как этот протокол может применяться для других РНК модификация ферментов.
Abstract
N6– isopentenyladenosine РНК изменения функционально различных и весьма сохраняется среди прокариот и эукариот. Одним из наиболее сохранившихся N6– isopentenyladenosine изменений происходит в A37 позиции в подмножестве tRNAs. Эта модификация повышает эффективность перевода и верности, увеличивая сродство tRNA для рибосомы. Мутация ферментов, ответственных за этой модификации в эукариот связаны с несколькими государствами болезни, включая митохондриальной дисфункции и рак. Таким образом понимание субстратная специфичность и биохимические деятельности этих ферментов имеет важное значение для понимания нормальных и патологических эукариотических биологии. Разнообразные методы был нанят для характеристики я6A изменения. Здесь будет описано прямой подход для выявления isopentenylation по Mod5. Этот метод использует инкубации РНК с рекомбинантным изопентенил трансферазы, следуют RNase T1 пищеварение и 1-мерного гель электрофорез анализ для выявления я6A изменения. Кроме того обсуждаются потенциальные адаптируемость настоящего Протокола охарактеризовать другие изменения РНК ферменты.
Introduction
Было выявлено по крайней мере 163 отдельных модификаций посттранскрипционного РНК, с этими изменениями, предоставление разнообразных и контекстно зависимые функции РНК, непосредственно влияющие на структуре РНК и затрагивающих взаимодействия РНК с другими молекулы1,2. С увеличением признательность за количество и разнообразие модификаций РНК, важно развивать анализов, которые могут надежно допросить изменения РНК и ферменты, которые катализируют их.
Одним из первых изменений РНК идентифицировать происходит на базовый 37 в tRNAs, прилегающих к борьбе с кодоном на 3′ стороне3,4. Группа изопентенил передается от dimethylallylpyrophosphate (ДМАФФ) в положение N6 аденозина 37 (я6A37) 3,5 на подмножестве цитоплазмы и митохондриальной tRNAs. я6A37 улучшает верности перевода и эффективности путем увеличения tRNA сродства рибосома4,6 и я6A37 имеет важное значение для реакции на стресс в бактерии7. Ферменты, которые выполняют эту модификацию называются трансферазы изопентенил тРНК и хорошо сохранились в бактерии8,9,10грибов, червей11, растения12и высших эукариот13 , включая14людей.
Мутации в изопентенил человека tRNA трансферазы генов, TRIT1, связаны с заболеваний человека. Например мутации в TRIT1 коррелирует с тяжелой формой болезни митохондрий, скорее всего вызвана дефектом синтеза белков митохондриальных15,16. Кроме того был описан как опухоль подавитель гена17,18 TRIT1 и замешан в нескольких типов рака, меланомы19, груди20, желудка21и рака легких22 ,23. Наконец TRIT1 и Mod5 изопентенил трансферазы (Saccharomyces cerevisiae) являются подверженных агрегации белков, которые формируют волокон амилоида китовая птичка как24,25,26. Эти наблюдения потенциально затрагивать трансферазы изопентенил tRNA в нейродегенеративных заболеваний, хотя прямых доказательств для этого еще не было показано.
Учитывая роль изопентенил трансферазы в перевод и болезней, методы, которые непосредственно измерить я6играть деятельность трансферазы изопентенил важны для механистического понимания этих ферментов в нормальных и болезни государства. Все большее количество методов для выявления я6РНК изменений, в том числе в пробирке isopentenylation анализов, позитивные гибридизации в отсутствие я6(PHA6) assays, тонкий слой хроматографии (ТСХ), аминокислоты прием анализов деятельности и масс-спектрометрии подходы (Проверено в ссылка 4).
Был описан в пробирке isopentenylation assay который использует 14C-ДМАФФ и непомеченного tRNAs. В этот assay радиоактивного углерода передается РНК из 14C-ДМАФФ изопентенил трансферазы. Хотя этот assay очень чувствительна, часто бывает трудно определить, что конкретные остатки, изменен9,20,27. PHA6 assays полагаются на громоздкие я6A модификация, мешая гибридизация зонда 32P-меченых охватывающих изменение остатков. Таким образом, гибридизация больше в отсутствие я6модификация18,,2829. PHA6 анализов весьма чувствительны и способны анализа всего РНК, извлеченные из клеточных лизатов. Кроме того возможность разработки конкретных зонды для РНК интерес дает гибкость существенной цели этот метод. Однако PHA6 анализов, ограничиваются характеристика изменений, которые происходят на остатки в рамках целевого региона зонда и поэтому менее склонны идентифицировать новые модификации сайтов. Кроме того как отсутствие привязки является показателем изменения, другие модификации или мутации, которые влияют на РНК привязки будет смешивать анализа данных.
Другой подход сочетает бензил открытое целлюлозы (BD) целлюлозы хроматографии с аминокислоты признание деятельности как индикация я6A изменения в tRNA30. Этот подход непосредственно assays функции i модификация6A, но он является косвенный подход для выявления я6A модификация и не хватает резолюции для сопоставления изменений в конкретные остатков в РНК. TLC подход был использован для обнаружения всего tRNA я6A изменения. В этом подходе внутренне 32P-меченых tRNAs перевариваются в одном нуклеотидов и двумерных TLC анализ используется для идентификации isopentenylation. Этот подход очень чувствительна в выявлении всего я6A в данной выборке РНК, но после переваривания, теряется вся информация последовательности; Таким образом следователь не имеет возможности определить, какие остатки были изменение31.
Совсем недавно, жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии (LC-MS/MS) были разработаны методы которые количественно сравнить общее РНК изменения между видами, типы клеток и экспериментальных условиях32,33, 34. Ограничением этой методики является в меньшей степени способны определить, что личность и положение внутри РНК, из которого модифицированных нуклеозидов был производным34. Кроме того опыт и оборудование, необходимое для выполнения этих экспериментов ограничивают практичность этого подхода.
Кроме того были разработаны несколько технологий следующего поколения последовательности для сопоставления РНК модификации транскриптом общесистемной34. Иммунопреципитация РНК с антител специфических для конкретной модификации (RIP-Seq) позволяют следователю для выявления всех последовательностей, содержащих конкретные модификации35,36. Кроме того подходов, основанных на обратной транскриптазы, такие Chem-Seq и неслучайных несоответствие последовательности полагаются на возмущения обратной транскрипции реакции на изменение остатков37,,3839. Несмотря на преимущество этих методов сопоставления РНК модификации транскриптом общесистемной RIP-seq и Chem-Seq технологии ограничены отсутствием надежных антител или реактивной химических веществ, доступных для каждой конкретной модификации, соответственно34. Кроме того обратная транскриптаза ферменты, необходимые для выполнения Chem-Seq и методы неслучайной несоответствие последовательности может сдерживаться стабильных структур РНК. Сильно изменен и структурно стабильный характер tRNAs сделать их особенно трудно допросить с помощью этих методов. На сегодняшний день, технологии следующего поколения на основе последовательности не еще были использованы для сопоставления я6изменения34.
Здесь мы опишем простой и прямой подход для выявления я6A tRNA изменения в пробирке. Этот метод использует инкубации РНК с рекомбинантной S. cerevisiae изопентенил трансферазы (Mod5), следуют RNase T1 пищеварение и анализ электрофорез 1-мерного гель для сопоставления я6A изменения. Этот подход является прямым и требует мало специалистов для анализа данных. Кроме того этот метод адаптируется для других РНК, изменяя ферментов, в том числе ферментов, которые ковалентно изменить молекулярная масса РНК или РНК мобильности через гель.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изменения РНК продолжают отображаться играть все более важную и разнообразные роли в клеточном и научные функции. Таким образом разработка анализов допросить РНК, изменяя ферменты центральное значение для лучшего понимания основополагающих аспектов биологии. Этот протокол описывае?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дэвида Engelke за его руководство и полезные комментарии на этой рукописи. PJS – Ball государственного университета Лаборатория запуска средств; DAB – Грант 1R15AI130950-01.
Materials
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).
- Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions. Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).
- Soll, D. Enzymatic modification of transfer RNA. Science. 173 (3994), 293-299 (1971).
- Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA. RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).
- Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA. Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).
- Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications. EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).
- Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation. RNA. 22 (5), 729-742 (2016).
- Caillet, J., Droogmans, L. Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA. Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop. Biochimie. 39 (21), 6546-6553 (2000).
- Dihanich, M. E., et al. Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).
- Lemieux, J., et al. Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria. Génétique. 159 (1), 147-157 (2001).
- Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).
- Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells. Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).
- Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase. Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).
- Kernohan, K. D., et al. Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene. Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).
- Yarham, J. W., et al. Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA. PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).
- Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer. Gene. 556 (1), 13-18 (2015).
- Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).
- Swoboda, R. K., et al. Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3′ untranslated region of TRIT1. Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).
- Yue, Z., et al. Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information. Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).
- Chen, S., et al. Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population. Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).
- Spinola, M., et al. Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer. Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).
- Spinola, M., et al. Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients’ survival. Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).
- Read, D. F., et al. Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing. FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).
- Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro. Gene. 612, 19-24 (2017).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues. Biochimie. 40 (6), 1734-1740 (2001).
- Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases. Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).
- Lamichhane, T. N., et al. Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).
- Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).
- Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence. Cell. 18 (1), 11-26 (1979).
- Yan, M., et al. A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes. Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).
- Su, D., et al. Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry. Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Dominissini, D., et al. The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
- Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3′ UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Schwartz, S., et al. Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA. Cell. 159 (1), 148-162 (2014).
- Schwartz, S., et al. High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis. Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).
- Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA. Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).
- Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tackling structures of long noncoding RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).
