Un ensayo In Vitro para detectar actividad de transferasa de Isopentenyl tRNA
Summary
Aquí, describimos un protocolo para la caracterización bioquímica de la enzima de modificación de RNA de la levadura, Mod5 y discutir cómo este protocolo podría aplicarse a otras enzimas de modificación de RNA.
Abstract
N6– isopentenyladenosine RNA modificaciones son funcionalmente diverso y altamente conservado entre procariotas y eucariotas. Una de las más altamente conservado N6– isopentenyladenosine modificaciones se produce en la posición de A37 en un subconjunto de tRNAs. Esta modificación mejora la eficiencia de la traducción y fidelidad mediante el aumento de la afinidad de los tRNA por el ribosoma. Mutación de las enzimas responsables de esta modificación en eucariotas están asociados con varios Estados de enfermedad, incluyendo cáncer y la disfunción mitocondrial. Por lo tanto, comprender la especificidad de sustrato y las actividades bioquímicas de estas enzimas es importante para la comprensión de la biología de eucariota normal y patológica. Una gran variedad de métodos se ha empleado para caracterizar i6A modificaciones. Es en este documento se describe un enfoque directo para la detección de isopentenylation por Mod5. Este método utiliza incubación de RNAs con recombinante isopentenyl transferasa, seguida por digestión Rnasa T1 y el análisis de electroforesis de gel 1-dimensional detectar modificaciones6A. Además, se discute la adaptabilidad potencial de este protocolo para caracterizar otras enzimas de modificación de RNA.
Introduction
Se han identificado al menos 163 distinta modificación postranscripcional de RNA, con estas modificaciones confieren funciones diversas y contextual para RNAs directamente influir en la estructura del RNA y que afectan a las interacciones de RNA con otros las moléculas1,2. A medida que aumenta la apreciación de la cantidad y variedad de modificaciones de RNA, es fundamental para desarrollar ensayos que pueden interrogar confiablemente las modificaciones del RNA y las enzimas que catalizan los.
Una de las primeras modificaciones de RNA para identificarse se produce en 37 base en tRNAs, adyacente al anti-codon en el 3′ parte3,4. Un grupo de isopentenyl se transfiere del dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) en la posición N6 de la adenosina 37 (me6A37) 3,5 en un subconjunto de tRNAs citoplásmica y mitocondrial. i6A37 mejora la fidelidad de la traducción y eficiencia aumentando la afinidad del ARNt por el ribosoma4,6 y yo6A37 es importante para la respuesta de estrés en las bacterias7. Las enzimas que realizan esta modificación se denominan transferasas de isopentenyl tRNA y están muy conservadas en bacterias8,9, hongos10, gusanos11, plantas12y eucariotas superiores13 , incluyendo los seres humanos14.
Las mutaciones en el gene humano de tRNA isopentenyl transferasa, TRIT1, están asociadas con enfermedad humana. Por ejemplo, una mutación en el TRIT1 se correlaciona con una severa enfermedad mitocondrial, probablemente causada por un defecto en la síntesis de proteínas mitocondriales15,16. Además, TRIT1 ha sido descrito como un tumor supresor genes17,18 y está implicada en varios tipos de cáncer incluyendo melanoma19, mama20, gástrico21y cánceres de pulmón22 ,23. Finalmente, TRIT1 y Mod5 transferasas de isopentenyl (Saccharomyces cerevisiae) son propensas a la agregación de proteínas que forman las fibras de amiloide-como prión24,25,26. Estas observaciones implican potencialmente transferasas de isopentenyl tRNA en enfermedades neurodegenerativas, aunque todavía no se ha demostrado evidencia directa para esto.
Dado el papel que isopentenyl transferasas en traducción y la enfermedad, métodos que directamente me miden6una actividad de transferasa de isopentenyl son importantes para una comprensión mecanicista de estas enzimas bajo normal y Estados de la enfermedad. Un número creciente de métodos está disponible para detectar modificaciones de una RNA6, incluyendo en vitro isopentenylation ensayos, hibridación positivo en ausencia de6ensayos (PHA6), delgada cromatografía (TLC), aminoácido ensayos de actividad de aceptación y métodos de espectrometría de masas (revisado en Ref. 4).
Un ensayo de isopentenylation en vitro se ha descrito que utiliza 14C-DMAPP y tRNAs sin etiqueta. En este ensayo, carbono radiactivo se transfiere al ARN de 14C-DMAPP por la transferasa de isopentenyl. Mientras que este ensayo es altamente sensible, a menudo es difícil determinar el residuo concreto que es modificada9,20,27. PHA6 ensayos dependen de la voluminosa me modificación6A interferir con la hibridación de una sonda marcada con P 32, que abarca el residuo modificado. Como tal, la hibridación es mayor en la ausencia de una i6una modificación18,28,29. PHA6 ensayos son muy sensibles y capaces de análisis de ARN total extraído de Lisados celulares. Además, la habilidad de diseñar sondas específicas de RNA de interés ofrece esta flexibilidad de método objetivo sustancial. Sin embargo, ensayos de PHA6 se limitan a la caracterización de las modificaciones que se producen en los residuos dentro de la región específica de la sonda y por lo tanto son menos propensos a identificar sitios de modificación novedosa. Además, como falta de Unión es indicativa de la modificación, otras modificaciones o mutaciones que afectan la Unión de la RNA se confundir análisis de datos.
Otro enfoque combina cromatografía de celulosa bencílico DEAE celulosa (BD) con actividad de aceptación de aminoácidos como una lectura de lo6A modificaciones en el tRNA30. Este enfoque ensayos directamente la función de la i modificación de6A, pero es una aproximación indirecta a detectar i6A modificación y carece de resolución para mapear modificaciones a un residuo específico en el ARN. Un enfoque del TLC se ha utilizado para detectar total tRNA i6A modificaciones. En este enfoque, internamente 32tRNAs P etiquetados son digeridos a nucleótidos individuales y análisis TLC bidimensional se utilizan para identificar el isopentenylation. Este enfoque es altamente sensible en la detección de i total6A en una muestra determinada de RNA pero sobre digestión, toda la información de secuencia se pierde; así, el investigador no tiene forma de determinar que los residuos han sido modificados31.
Más recientemente, se han desarrollado métodos líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS) que comparar cuantitativamente la total modificación de RNA entre especies, tipos celulares y condiciones experimentales32,33, 34. Una limitación de esta metodología es que es menos capaz de determinar la identidad y posición en el ARN que los nucleósidos modificados fue derivan34. Además, la experiencia y el equipo necesario para ejecutar estos experimentos limitan la utilidad de este enfoque.
Además, se han desarrollado varias tecnologías de secuenciación de próxima generación para RNA modificaciones todo el transcriptoma34. Inmunoprecipitación de RNAs con anticuerpos específicos a una modificación especial (RIP-Seq) permiten al investigador a identificar todas las secuencias que contiene una modificación específica35,36. Además, enfoques basados en la transcriptasa reversa como Chem-Seq y secuencia del desajuste no aleatoria se basan en las perturbaciones de la reacción de transcripción inversa en los residuos modificados37,38,39. A pesar de la ventaja de estas técnicas para asignar todo el RNA modificaciones transcriptoma, RIP-seq y Chem-Seq tecnologías están limitadas por la falta de anticuerpos confiables o disponible para cada modificación específica, respectivamente34reactivos químicos. Además, las enzimas transcriptasa reversa necesaria para realizar Chem-Seq y técnicas de secuenciación de desajuste no aleatoria pueden verse obstaculizadas por las estructuras de RNA estables. La naturaleza altamente modificada y estructuralmente estable de tRNAs hacen especialmente difíciles de interrogar utilizando estas técnicas. Hasta la fecha, tecnologías de secuenciación de próxima generación no se han utilizado todavía para mapa i6una modificaciones34.
Adjunto, describimos un enfoque simple y directo detectar6un tRNA modificaciones in vitro. Este método utiliza incubación de RNAs con recombinante S. cerevisiae isopentenyl transferasa (Mod5), seguido por digestión Rnasa T1 y el análisis de electroforesis de gel de 1 dimensión para mapa i6A modificaciones. Este enfoque es directo y requiere poco especializados para analizar los datos. Además, este método es adaptable a otros RNA modificación de enzimas, incluyendo enzimas que modifican covalentemente el peso molecular del ARN o movilidad de un RNA a través de un gel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modificaciones de RNA continúan ser demostrado que desempeñan un papel cada vez más importantes y diversas en función celular y organismo. Como tal, el desarrollo de ensayos para interrogar RNA enzimas modificadoras es central para comprender mejor los aspectos fundamentales de la biología. Este protocolo describe un análisis de alta resolución de vitro para caracterizar la actividad de modificación de tRNA de Mod5.
Este protocolo tiene la clara ventaja de proporcionar una lec…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Dr. David Engelke por su orientación y comentarios sobre este manuscrito. Pijamas – fondos de puesta en marcha de laboratorio de Ball State University; DAB – concesión 1R15AI130950-01.
Materials
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
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