TRNA Isopentenyl 전이 효소 활동을 감지 하는 체 외에서 분석 결과

Summary

우리가 효 모 RNA 수정 효소, Mod5, 생 화 확 적인 특성에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기,이 프로토콜 다른 RNA 수정 효소 적용할 수 토론.

Abstract

N⁶-isopentenyladenosine RNA 수정 기능 다양 하 고 높은 원핵생물과 진핵생물 사이에서 보존 있습니다. 가장 높은 보존된 N⁶-isopentenyladenosine 수정 중 tRNAs의 하위 집합에서 A37 위치에서 발생합니다. 이 수정 리보솜에는 tRNA의 선호도 증가 시켜 번역 효율성과 충실도 향상 시킵니다. 효소는 진핵생물에서이 수정에 대 한 책임의 돌연변이 미토 콘 드 리아 기능 장애, 암 등 여러 질병 상태와 연결 됩니다. 따라서, 기질 특이성 및 이러한 효소의 생 화 확 적인 활동 이해 정상과 pathologic 진 핵 생물의 이해를 위해 중요 하다. 방법의 다양 한 배열은⁶A 수정 난을 특성화 하기 위해 고용 되었다. 여기는 isopentenylation Mod5에 의해의 검출에 대 한 직접적인 접근을 설명. 이 방법은 재조합 isopentenyl 전이 효소, RNase T1 소화 및⁶A 수정 난을 검출 하기 위하여 1 차원 젤 전기 이동 법 분석 가진 RNAs의 외피를 사용 합니다. 또한, 잠재적인 적응성이의이 정서의 다른 RNA 수정 효소의 특성을 설명 합니다.

Introduction

적어도 163 가지 posttranscriptional RNA 수정 확인 되었습니다, RNAs에 맞는 다양 한 기능을 부여, 직접 영향을 미치는 RNA 구조, 및 다른 RNA의 상호 작용에 영향을 미치는 이러한 수정 분자^1,2. 수와 다양 한 RNA 수정에 대 한 감사는 증가, 그것은 안정적으로 RNA 수정 및 그들을 촉매 하는 효소를 심문 수 분석 실험 개발에 중요 한.

발견 될 첫번째 RNA 수정 중 기본 37 tRNAs, 3′ 사이드^3,4안티 codon에 인접 한에서 발생 합니다. Isopentenyl 그룹 dimethylallylpyrophosphate (DMAPP)에서 아데노신 37의 N6 위치 전송 됩니다 (난⁶A37) 세포질 및 미토 콘 드리 아 tRNAs의 하위 집합에 ^3,5 . 난⁶A37 번역 충실도 향상과⁶리보솜^4,6 , tRNA의 선호도 증가 시켜 효율성 A37 박테리아⁷스트레스 반응에 대 한 중요 하다. 이 수정 수행 하는 효소 tRNA isopentenyl transferases 불린다 고 높은 박테리아^8,9, 버섯¹⁰, 벌레¹¹, 식물¹²및 높은 진핵생물^{13 보존 됩니다.} , 인간¹⁴를 포함 하 여.

돌연변이 인간 tRNA의 isopentenyl 전이 효소 유전자, TRIT1에서 인간의 질병과 연결 되어 있습니다. 예를 들어 TRIT1 에 돌연변이 가능성이 미토 콘 드리 아 단백질 합성^15,16결함으로 인 한 심각한 미토 콘 드 리아 질병으로 상관 된다. 또한, TRIT1 는 종양 억제기 유전자^17,18 으로 설명 하고있다 고 암 흑색 종¹⁹, 유 방²⁰, 위²¹, 폐 암^{22 등의 여러 종류에 연루 ,23}. 마지막으로, TRIT1 및 Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl transferases 집계 경향이 단백질 프리온 같은 녹말 체 섬유^24,,2526를 형성 하는. 이 관측은 잠재적으로 있지만이 대 한 직접적인 증거는 아직 표시 되지 tRNA isopentenyl transferases 신경 퇴행 성 질환에 연루.

Isopentenyl transferases 번역 및 질병, 직접 내가⁶측정 방법에서 isopentenyl 전이 효소 활동 재생 역할을 감안할 때 이러한 정상에서 효소와 질병 상태에 대 한 기계적 이해에 대 한 중요 하다. 방법의 증가 나⁶A RNA 수정, 포함 한 생체 외에서 isopentenylation 분석 실험, 긍정적인 교 잡 검출을 사용할 수 있습니다 나의 부재에⁶(PHA6) 분석 실험, 얇은 층 크로마토그래피 (TLC), 아미노산 수용 활동 분석 실험, 그리고 질량 분석 접근 (참고 ⁴검토 됨).

생체 외에서 isopentenylation 분석 결과 활용 ¹⁴C DMAPP 및 레이블이 tRNAs 설명 하고있다. 이 분석 결과에서 방사성 탄소 isopentenyl 전이 효소에 의해 ¹⁴C DMAPP에서에서 RNA를 전송 됩니다. 이 분석 결과 매우 중요 한, 그것은 종종 특정 잔류물은^9,,2027수정 확인 어렵다. PHA6 분석 실험에 의존 하는 부피 나⁶A 수정 수정 된 잔류물에 걸친 ³²P 표시 된 프로브의 교 잡에 방해가. 이와 같이, 교 잡 이다 i의 부재에서 더 큰⁶수정^18,,2829. PHA6 분석 실험 매우 민감하고 세포 lysates에서 추출한 총 RNA를 분석 할 수 있습니다. 또한, 프로브 특정 관심의 RNA 설계 하는 능력이 방법은 상당한 대상 유연성을 제공 합니다. 그러나, PHA6 분석 실험의 수정 따라서 소설 수정 사이트를 식별 하는 조사의 대상된 지역 내에서 잔류물에 발생 하는 특성으로 제한 됩니다. 또한,로 바인딩의 부재는 수정, 다른 수정 또는 RNA 바인딩에 영향을 주는 돌연변이 데이터 분석을 혼동 됩니다.

또 다른 방법은 결합 벤 DEAE 셀 루 로스 (BD) 셀 루 로스 크로마토그래피 아미노산 수용 활동의 판독으로 tRNA³⁰⁶A 수정 합니다. 이 방법은 직접 기능을 분석 실험 i의⁶A 수정, 하지만 난⁶A 수정 감지 하는 간접 접근 이며 매핑하는 RNA에서 특정 잔류물에 수정 해상도 결여. TLC 접근 총 tRNA를 감지 하는 데 사용 되었습니다 내가⁶A 수정. 이 방법에서는, 내부적으로 ³²P 라는 tRNAs 단일 뉴클레오티드를 소화 하 고 2 차원 TLC 분석은 isopentenylation를 식별 하는 데 사용 됩니다. 이 방식은 매우 민감한 탐지에 나에 게 주어진 RNA 샘플에서⁶A 총 이지만, 소화 시 모든 시퀀스 정보 손실; 따라서, 조사는 잔류물 수정된³¹되었습니다 결정의 방법이 있다.

더 최근에, 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 방법은 개발 되었다 종, 세포 유형, 및 실험 조건^{32,33, 사이 총 RNA 수정 양적 비교 하 34}. 이 방법론의 한계 덜 id와 위치를 수정된 nucleoside 했다 RNA 내에서 파생 된³⁴확인할 수입니다. 또한, 전문성 및 장비 이러한 실험을 실행 하는 데 필요한이 방법의 실용성을 제한 합니다.

또한, 여러 가지 차세대 시퀀싱 기술은 매핑할 RNA 수정 transcriptome 전반³⁴개발 되었습니다. 특정 수정 (RIP-Seq) 특정 항 체와 RNAs의 Immunoprecipitation 사용 특정 수정^35,36를 포함 하는 모든 시퀀스를 식별 하는 탐정. 또한, 화학-Seq 등 비 무작위 불일치 시퀀싱 역전사-기반 접근 수정된 잔류물^37,,3839에서 반전 녹음 방송 반응의 물결에 의존합니다. RNA 수정 transcriptome-넓은 지도를 이러한 기술의 장점에도 불구 하 고 RIP seq 시퀀스 (Seq) 화학 기술과 신뢰할 수 있는 항 체 또는 각 특정 수정, 각각³⁴에 사용할 수 있는 반응 화학 물질의 부족에 의해 제한 됩니다. 또한, 역전사 효소 화학-Seq를 수행 하는 데 필요한 및 비-무작위 불일치 시퀀싱 기술을 안정 RNA 구조에 의해 장애가 수 있습니다. 높은 수정 하 고 구조적으로 안정적인 성격의 tRNAs 어려워질 그들 특히 이러한 기술을 사용 하 여가. 날짜 하려면, 다음-세대 시퀀싱 기반 기술은 하지 아직 이용 되어⁶수정³⁴나을 지도.

여기, 내가⁶A tRNA 수정 체 외검출 하는 간단 하 고 직접적인 접근 방식을 설명 합니다. 이 방법은 RNAs 재조합 S. cerevisiae isopentenyl 전이 효소 (Mod5)와 RNase T1 소화 및 1 차원 젤 전기 이동 법 분석 나⁶A 수정 지도 하의 외피를 활용 합니다. 이 방법은 직접 이며 데이터를 분석 하는 작은 특수 전문 지식이 필요로. 또한,이 메서드는 다른 RNA 효소, RNA 또는 젤 통해 RNA의 이동성의 분자량 covalently 변경 효소를 포함 하 여 수정에.

Protocol

참고: 프로토콜 참고. 24에서 적응 시켰다. 1. RNA와 관심의 효소를 얻을 사용에서 생체 외에서 복사할 RNAs 내부적으로 32P, 표시 된 재조합 His6-Mod5 표현 하 고 대장균, 앞에서 설명한24에서 정화. 소개 생체 외에서 복사할 RNAs (제 3) 레이블이 ATP, UTP, CTP, GTP와 젤 정화, 에탄올 침전 α-ATP의 10 µCi의 T7 RNA 중…

Representative Results

Mod5는 티로신과 알을 품는 tRNA 또는 떠들고 DMAPP의 유무에 tRNA. 수정 반응에 따라 제품 있었다 RNase T1 소화는 앞 3′ guanosine monophosphates (GMP)24 (그림 1)을 떠나 모든 guanosines의 3′ 끝. 전체 소화는 RNAs의 방사선된 파편 (그림 2A), 다음 20 %polyacrylamide 젤을 변성 시키기에 해결의 예측 가능한 패턴을 생성 합?…

Discussion

RNA 수정 계속 세포질 organismal 기능에 더 중요 하 고 다양 한 역할을 표시 합니다. 따라서, 수정 효소 RNA가 분석의 개발 생물학의 기본적인 측면을 이해 하는 더 나은 중심입니다. 이 프로토콜에는 고해상도 생체 외에서 분석 결과를 Mod5의 tRNA 수정 활동의 특성을 설명 합니다.

이 프로토콜 제공 하는 isopentenylation의 직접적인, 그리고 쉽게 해석할 판독의 뚜렷한 장점이 있?…

Materials

Reagents
UreaGel Concentrate	National Diagnostics	EC-833	As part of a kit
UreaGel Diluent	National Diagnostics	EC-833	As part of a kit
UreaGel Buffer	National Diagnostics	EC-833	As part of a kit
10x TBE	National Diagnostics	EC-833	As part of a kit
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	7727-54-0
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED)	Sigma-Aldrich	T9281
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503
Boric acid	Sigma-Aldrich	10043-35-3
EDTA	Sigma-Aldrich	60-00-4
ATP	Sigma-Aldrich	34369-07-8
MgCl2	Sigma-Aldrich	7786-30-3
DMAPP	Caymen Chemical	1186-30-7
Super RNaseIN	ThermoFisher Scientific	AM2694
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	60-24-2
Ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
Sodiume acetate	Sigma-Aldrich	127-09-3
Rnase T1	ThermoFisher Scientific	EN0541
Glycerol	Sigma-Aldrich	56-81-5
Xylene cyanol	Sigma-Aldrich	2650-17-1
Equipment and Supplies
Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)	The Gel Company
Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)	The Gel Company
Vertical gel apparatus	The Gel Company	S2-3040
50 mL disposable syringe	Fisher Scientific	03-377-26
Stainless steel binder clips	Idea Scientific	1066
Phosphoscreen	Sigma-Aldrich	28-9564-74
Plastic wrap	(local grocery store)