I Vitro analysen å oppdage tRNA-Isopentenyl Transferase aktivitet
Summary
Her beskriver vi en protokoll for biokjemiske karakterisering av gjær RNA-modifisere enzym, Mod5, og diskutere hvordan denne protokollen kan brukes til andre RNA-modifisere enzymer.
Abstract
N6– isopentenyladenosine RNA modifikasjoner er funksjonelt varierte og høyt konservert blant prokaryoter og eukaryoter. En av de mest høyt konservert N6– isopentenyladenosine modifikasjonene oppstår ved hovedvei A37 plassering i et delsett av tRNAs. Denne endringen forbedrer oversettelse effektivitet og kvalitet ved å øke affinitet av tRNA for ribosomet. Mutasjon av enzymer som er ansvarlig for denne endringen i eukaryoter er forbundet med flere sykdom stater, inkludert mitokondrie dysfunksjon og kreft. Forstå substrat spesifisitet og biokjemiske aktiviteter av disse enzymer er derfor viktig for forståelse av normal og patologisk eukaryote biologi. Et variert utvalg av metoder har vært ansatt som karakteriserer jeg6en modifikasjoner. Her er beskrevet en direkte tilnærming for påvisning av isopentenylation av Mod5. Denne metoden bruker inkubasjonstiden for RNAs med en rekombinant isopentenyl transferase, etterfulgt av RNase T1 fordøyelsen og 1-dimensjonal geleelektroforese analyse for å oppdage6en modifikasjoner. I tillegg drøftes potensielle tilpasningsevne denne protokollen til å beskrive andre RNA-modifisere enzymer.
Introduction
Minst 163 distinkte posttranscriptional RNA endringer har blitt identifisert, med disse endringene overdragelse varierte og kontekst-avhengige funksjoner til RNAs direkte påvirke RNA struktur og påvirker interaksjoner av RNA med andre molekyler1,2. Som anerkjennelse for antallet og variasjonen av RNA modifikasjoner øker, er det avgjørende å utvikle analyser som kan pålitelig forhøre både RNA endringene og enzymer som katalysere dem.
En av de første RNA modifikasjonene identifiseres skjer ved base 37 i tRNAs, ved siden av anti-codon på 3 side3,4. En isopentenyl gruppe er overført fra dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) til N6 stillingen adenosin 37 (jeg6hovedvei A37) 3,5 på et delsett av både cytoplasmatiske og mitokondrie tRNAs. Jeg6hovedvei A37 forbedrer oversettelse kvalitet og effektivitet ved å øke den tRNA affinitet for ribosom4,6 og jeg6hovedvei A37 er viktig for stressrespons i bakterier7. Enzymer som utfører denne endringen kalles tRNA isopentenyl transferases og er svært bevart i bakterier8,9, sopp10, ormer11, planter12og høyere eukaryoter13 , inkludert mennesker14.
Mutasjoner i menneskelig tRNA isopentenyl transferase genet, TRIT1, er tilknyttet for menneskelig sykdom. For eksempel er en mutasjon i TRIT1 korrelert med en alvorlig mitokondrie sykdom, trolig forårsaket av en feil i mitokondrie protein syntese15,16. Videre TRIT1 har blitt beskrevet som en tumor suppressor genet17,18 og er involvert i flere typer kreft inkludert melanom19, bryst20, mage21og lunge kreft22 ,23. Til slutt, TRIT1 og Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl transferases er utsatt for aggregering proteiner som danner prion-lignende amyloid fiber24,25,26. Disse observasjonene implisere potensielt tRNA isopentenyl transferases i nevrodegenerative sykdommer, selv om direkte bevis for dette ikke har ennå vist.
Gitt rollen som isopentenyl transferases spiller i oversettelse og sykdom, metoder som direkte måler jeg6en isopentenyl transferase aktivitet er viktig for en mekanistisk forståelse av disse enzymer under normal og sykdomstilstander. Et økende antall metoder er tilgjengelige til å oppdage6A RNA endringer, inkludert i vitro isopentenylation analyser, positiv hybridisering i fravær av jeg6en (PHA6) søk, tynne lag kromatografi (TLC), aminosyre aksept aktivitet analyser og massespektrometri tilnærminger (anmeldt i Ref. 4).
I vitro isopentenylation analysen har blitt beskrevet som benytter 14C-DMAPP og umerkede tRNAs. I denne analysen overføres radioaktivt karbon til RNA fra 14C-DMAPP av isopentenyl-transferase. Denne analysen er svært følsom, er det ofte vanskelig å fastslå den spesifikke resten som er endret9,20,27. PHA6 analyser stole på den store jeg6en endring forstyrrer blanding av en 32P-merket probe spenner endret rester. Slik hybridisering er større i fravær av en jeg6en endring18,28,29. PHA6 analyser er svært følsomme og i stand til å analysere total RNA utvunnet fra mobilnettet lysates. I tillegg gir muligheten til å utforme sonder spesielt for RNA rundt denne metoden betydelig målet fleksibilitet. PHA6 analyser er imidlertid begrenset til karakterisering av endringer som skjer på rester i målrettede området av sonden og er derfor mindre sannsynlig å identifisere romanen endring områder. I tillegg som fravær av binding er et tegn på endring, vil andre endringer eller mutasjoner som påvirker RNA bindende forvirre dataanalyse.
En annen tilnærming kombinerer benzyl DEAE cellulose (BD) cellulose kromatografi med aminosyre aksept aktivitet som en presentasjon av jeg6en endringer i tRNA30. Denne tilnærmingen direkte søk funksjonen av i6en endring, men det er en indirekte oppdage6en endring og mangler oppløsning å kartlegge endringer i en bestemt rester i RNA. En TLC tilnærming er brukt til å oppdage totalt tRNA jeg6en modifikasjoner. I denne tilnærmingen, internt 32P-merket tRNAs er fordøyd å enkelt nukleotider og todimensjonal TLC analyse brukes til å identifisere isopentenylation. Denne fremgangsmåten er svært følsom oppdage totalt jeg6en i en gitt RNA prøve men på fordøyelsen, alle oppstartsrekkefølgen er tapt; Dermed har etterforskeren ingen måte å bestemme hvilke rester er endret31.
Flere nylig, flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) metoder har blitt utviklet som kvantitativt sammenligner totalt RNA endringer mellom arter, celletyper og eksperimentelle forhold32,33, 34. En begrensning av denne metoden er at det er mindre i stand til å bestemme identiteten og posisjon i RNA som den endrede nukleosid var avledet34. Videre begrense kompetanse og utstyr som er nødvendig for å utføre disse eksperimentene praktisk bruk av denne tilnærmingen.
I tillegg er flere neste generasjons sekvensering teknologi utviklet for å tilordne RNA endringer transcriptome hele34. Immunoprecipitation av RNAs med antistoffer spesifikke for en bestemt endring (RIP-Seq) aktiverer etterforskeren å identifisere alle sekvenser som inneholder en bestemt endring35,36. I tillegg stole revers transkriptase tilnærminger som Chem-Seq og ikke tilfeldig konflikt sekvensering på forstyrrelser av omvendt transkripsjon reaksjon på endrede rester37,38,39. Til tross for fordelen av disse teknikkene til å tilordne RNA endringer transcriptome hele, er RIP-seq og Chem-Seq teknologier begrenset av mangel på pålitelige antistoffer eller reaktive kjemikalier tilgjengelig for hver bestemte endringer, henholdsvis34. Videre revers transkriptase enzym kreves for å utføre Chem-Seq og ikke tilfeldig konflikt sekvensering teknikker kan hindres av stabil RNA. TRNAs svært modifisert og strukturelt stabil natur gjør dem spesielt vanskelig å forhøre disse teknikkene. Hittil har neste generasjons sekvensering-baserte teknologier ikke ennå blitt benyttet til map6en modifikasjoner34.
Her beskriver vi en enkel og direkte tilnærming til å oppdage6en tRNA endringer i vitro. Denne metoden bruker inkubasjonstiden for RNAs med rekombinant S. cerevisiae isopentenyl transferase (Mod5), etterfulgt av RNase T1 fordøyelsen og 1-dimensjonal geleelektroforese analyse til map6en modifikasjoner. Denne tilnærmingen er direkte og krever lite spesialisert kompetanse til å analysere dataene. Videre, denne metoden er tilpasningsdyktig til andre RNA endre enzymer, inkludert enzymer som covalently endrer molekylvekt av RNA eller en RNA mobilitet gjennom en gel.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA modifikasjoner fortsette å vises å spille stadig mer viktig og ulike roller i mobilnettet og organismebiologi funksjon. Slik er utvikling av analyser avhøre RNA endre enzymer sentralt for bedre forstå de grunnleggende sidene ved biologi. Denne protokollen beskriver en høy oppløsning i vitro analysen betegner tRNA endring aktiviteten til Mod5.
Denne protokollen har klar fordel av å gi en direkte og enkelt interpretable avlesning av isopentenylation. Protokollen beskrevet gir…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Dr. David Engelke for hans veiledning og nyttige kommentarer på dette manuskriptet. PJS – Ball State University laboratorium oppstart kapital; DAB – gi 1R15AI130950-01.
Materials
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).
- Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions. Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).
- Soll, D. Enzymatic modification of transfer RNA. Science. 173 (3994), 293-299 (1971).
- Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA. RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).
- Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA. Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).
- Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications. EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).
- Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation. RNA. 22 (5), 729-742 (2016).
- Caillet, J., Droogmans, L. Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA. Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop. Biochimie. 39 (21), 6546-6553 (2000).
- Dihanich, M. E., et al. Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).
- Lemieux, J., et al. Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria. Génétique. 159 (1), 147-157 (2001).
- Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).
- Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells. Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).
- Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase. Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).
- Kernohan, K. D., et al. Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene. Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).
- Yarham, J. W., et al. Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA. PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).
- Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer. Gene. 556 (1), 13-18 (2015).
- Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).
- Swoboda, R. K., et al. Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3′ untranslated region of TRIT1. Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).
- Yue, Z., et al. Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information. Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).
- Chen, S., et al. Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population. Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).
- Spinola, M., et al. Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer. Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).
- Spinola, M., et al. Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients’ survival. Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).
- Read, D. F., et al. Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing. FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).
- Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro. Gene. 612, 19-24 (2017).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues. Biochimie. 40 (6), 1734-1740 (2001).
- Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases. Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).
- Lamichhane, T. N., et al. Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).
- Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).
- Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence. Cell. 18 (1), 11-26 (1979).
- Yan, M., et al. A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes. Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).
- Su, D., et al. Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry. Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Dominissini, D., et al. The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
- Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3′ UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Schwartz, S., et al. Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA. Cell. 159 (1), 148-162 (2014).
- Schwartz, S., et al. High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis. Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).
- Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA. Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).
- Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tackling structures of long noncoding RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).
