Summary
여기 우리가 준비 하 고 유지 하는 메 다카 (Oryzias latipes)에서 기본 뇌 세포 배양 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜에 최적화 된 조건을 고려 온도, osmolality, pH 등의 중요 한 매개 변수 흉내 낸 함으로써 생리 적으로 더 의미 있는 결과 물고기의 생리 적 조건에 의해.
Abstract
1 차 세포 배양 세포 속성 및 제어 된 환경에서 격리 된 셀의 메커니즘 연구 과학자 들에 의해 일반적으로 사용 되는 강력한 도구입니다. 포유류와 물고기 사이 생리에 광대 한 차이도 불구 하 고 물고기에서 기본 세포 문화 프로토콜 종종 기반으로 포유류 문화 조건, 자주만 약간 수정 합니다. 환경 차이는 체온 뿐만 아니라 혈 매개 osmolality, pH, 그리고 pH 버퍼 용량에 영향을. 셀 문화 미디어와 유사한 작업 솔루션 extracellular 액체 또는 혈액 혈 청에는 셀이 적응의 특성을 모방 의미는, 그것은 중요 이러한 매개 변수에 동물을 특별히 조정 됩니다.
현재 프로토콜 메 다카 (Oryzias latipes)에 대 한 최적화 된 기본 문화 조건을 설명합니다. 프로토콜과 격리 하 고 건강 한 유지 하는 방법에 자세한 내용은 1 주일 이상에 대 한 뇌 세포를 해리 하 여 제공 하는 다음 단계가 포함 됩니다: 1. 값 osmolality 조정 메 다카 혈액 플라스마, 2에서에서 발견.의 조정에 부 화 온도 정상 메 다카 온도를 (여기 수족관 시설에서), 3. 비슷한 온도에서 사는 다른 어 종에 비해 값을 pH와 중 탄산염 버퍼의 조정. 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 결과 메 다카에 대 한 생리 적으로 의미 있는 결과 홍보 하 고 다른 비 포유류 종에서 1 차 셀 문화를 만드는 과학자 참조 가이드로 사용할 수 있습니다.
Introduction
세포 배양 정상적인 세포질 생리학에서 마약 검사 및 발암1에 이르기까지 생물학 질문에 응답 하기 위한 우수한 모델 시스템을 제공 하는 분자 생물학 연구에 사용 되는 주요 도구 중 하나입니다. 1 차 셀, 효소 및 기계적인 방법을 사용 하 여 동물 조직에서 직접 분리는 종종 세포 보다 더 생물학적으로 관련 생물학 응답 vivo에서 상황에 가까이 있을 수 있습니다 간주 됩니다. 1 차 셀 문화를 준비 하기 위한 프로토콜 관심 있는 셀은 적응 하는 특성을 모방 하 고 생리 적으로 의미 있는 결과 얻을 각 종 및 세포 유형에 최적화 되어야 합니다.
물고기 세포에 대 한 기본 문화권 조건을 설명 하는 유사한 프로토콜에 비해 다소 부족 한 반면 수많은 프로토콜 포유류 세포 시스템에 대 한 문화 조건을 설명 합니다. 셀 온도, pH, 그리고 osmolality, 빠른 변화에 취약 하며 분리 절차 중 특히 취약 합니다. 상업적인 소금 솔루션 포유류 세포 배양에 사용 되는 문화 미디어 pH 버퍼 시스템 조건과 osmolality 특히 teleost 생선에 적합 하지 않습니다. 그것은, 그러므로, 측정 솔루션 관심의 종에서 이러한 매개 변수의 순수 관련 레벨을 조정 하는 것이 중요.
일반적인 잉어를 포함 하 여 여러 teleost 물고기 종에서 한 주 하 문화 (Cyprinus 카 르 피 오)2,3, 잔디 잉어 (Ctenopharyngodon idella)4, 금붕어 (auratus 떡 )5, 무지개 송어 (Oncorhynchus mykiss)6, 유럽 뱀장어 (앵귈라 앵귈라)7, 틸 라 피아 (Oreochromis mossambicus)8, zebrafish (Danio rerio)9, 그리고 대서양 대구 (Gadus morhua)10. 관심의 종 부 화 온도 조정 외에도 이러한 프로토콜의 몇 가지가지고 인 큐베이 팅 관심, 습도 분위기에서 7.5 7.2에서 ph의 종 차선 수 있는 포유류-같은 조건에서 셀 포함 하는 3-5% CO2. 또한, 그것은 이러한 기본 세포 배양의 여러 준비에 사용 되는 솔루션의 osmolality 조정 된 경우에 불분명 하 고 다른 솔루션 사이의 안정적인.
현재 프로토콜 대서양 대구10 주 문화 이전 작업에 따라 고을 부 화 온도, osmolality, pH, 그리고 이산화탄소 (pCO2)의 부분 압력을 포함 하 여 pH 버퍼 시스템의 구성 메 다카 (O. latipes)의 생리학. 메 다카는 작은 (3-4 cm) 민물고기 이다, 동쪽 아시아. 이 요즘, 그것 사용 된다 세계의 많은 연구소에서 모델 종으로 그것은 상대적으로 쉽게 번 식 하 고 많은 일반적인 물고기 질병11저항력. 여러 이점이 있다 모델로, 4-40 ° C11, 짧은 생성 시간, 투명 한 태아, 성 결정 유전자12, 그리고 시퀀스 게놈13, 뿐만 아니라에서 많은 온도 허용 오차를 포함 하 여 메 다카를 사용 하 여 다른 사용 가능한 유전 자원입니다.
이 프로토콜의 기본 문화 조건 medakas 물고기 시설에서에 보관 되는 26 ° C의 온도 맞게 최적화 됩니다. 또한,는 osmolality 290 mOsm/kg 담 수에 살고 있는 메 다카를 소금물에 살고 있는 대서양 대구에서 320 mOsm/kg에서 감소 되 고 메 다카 플라즈마14의 정상적인 osmolality은. 비교에서는, 포유류 플라즈마의 전형적인 osmolality 275-295 mOsm15의 범위입니다. 다양 한 온도에서 살고 물고기 고 물고기 포유류에서 다른 혈액과 세포 외 액의 pH와 버퍼 용량을 만드는 물과 직접 접촉에 있는 아가미. 포유류 문화 미디어는 pH 약 7.4의 미디어는 37 ° c.에 습도 공기에 5% CO2 의 표준 분위기 equilibrated 때 발생 하는 버퍼 시스템에 일반적으로 포함 됩니다. PH는 온도 의존 및 감소 온도16(물)에 중립 pH 증가 대 한 값입니다. 전형적인 teleost 물고기 플라스마 pH 7.9177.7에서 배열 한다. 이 프로토콜의 최적화는 pH 7.85 pH 7.75 메 다카는 CO2 0.5%에서 1%로 증가 하 여 26 ° C에서 보관에 12 ° C에서 보관 하는 대구에서에서 감소를 포함.
또한, 중 탄산염 버퍼 용량 물고기와 포유류에서 매우 다르다. CO2 물고기에서 아가미를 통해 쉽게 교환 이며 물에 pCO2 폐18에서 pCO2 의 극히 일부에. 온도 또는 pCO2 변경 하는 것은 pH와 매체의 버퍼 변경 됩니다. 따라서, pH도 포유류 세포 배양에 대 한 권장 pCO2 물고기 셀에 최적 이며 따라서, 문화 미디어는 물고기에 대 한 순수 관련 값을 포함 하는 버퍼 시스템으로 최적화 되어야 합니다 그리고 특정 관심의 종입니다. 이 프로토콜 메 다카 pituitaries에서 1 차 셀 문화를 준비 하 고 조정 부 화 온도, osmolality, pH, 그리고 pH 버퍼 시스템의 1 차 셀을 준비할 때 고려해 야 할 다른 중요 한 매개 변수 외에 포함 하는 방법을 설명 합니다. 문화 비 포유류 종에서.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 연구에서 동물 실험은 생명 과학, 관리 및 연구 동물의 복지에 대 한 다음 지침의 노르웨이 대학에 의해 승인 되었다.
1입니다. 솔루션의 준비
- 정확한 측정을 위해 제조업체의 지침에 따라 osmometer 및 pH 미터 계기 보정.
-
캘리포니아2 +-와 Mg2 +500ml를 준비-Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (dPBS), 7.75 (단계 1.2.1)을 pH와 290 mOsm/kg (단계 1.2.2) 살 균 여과 (1.2.3 단계) 전에 osmolality 조정 무료.
- 신중 하 게 신중 하 게 해결책을 교 반 하면서 방울 1 M NaOH 솔루션을 추가 하 여 보정 된 pH 미터 7.75에 pH를 조정 합니다.
- 보정된 osmometer를 사용 하 여 솔루션의 osmolality 측정 하 고 마 니 톨 290 mOsm/kg osmolality 증가 하는 데 필요한 금액을 계산. 마 니 톨의 필요한 금액을 추가 하 고 다시 올바른 조정 되도록 솔루션의 osmolality 측정.
참고: 필요한 마 니 톨의 크기는 일반적으로 다른 배치 사이 변화 한다, 측정 osmolality에 따라 다릅니다. 마 니 톨에의 한 분자 1 삼 투 입자를 같습니다. - 멸 균 필터 dPBS 솔루션 0.2 µ m 필터를 사용 하 여.
참고: 솔루션 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 3 개월 이상.
- L-글루타민 및 중 탄산염, Leibovitz (L-15) 문화 매체의 500 mL를 준비 하 고 그것은 10 mm NaHCO3 (단계 1.3.1), 4.5 m m 포도 당 (1.3.2), 단계 및 2mm 상용 글루타민 (1.3.3 단계) 보완. 290 mOsm/kg (1.3.4), 단계에 대 한 해결책을 조정 살 균 필터 그것 (1.3.5 단계), 페니실린 스 솔루션 (단계 1.3.6)의 2.5 mL을 추가.
참고: 솔루션 저장할 수 있습니다 4 ° C에 적어도 4 주 동안.- 10 m m 솔루션을 달성 하기 위해 문화 매체의 500 mL 당 NaHCO3 의 420 mg을 추가 합니다.
- 4.5 m m 솔루션을 달성 하기 위해 문화 매체의 500 mL 당 포도 당의 405 mg을 추가 합니다.
- 2mm 솔루션을 달성 하기 위해 문화 매체의 500 mL에 글루타민 솔루션의 100 x 재고의 5 mL를 추가 합니다. 모든 용액 해산 때까지 휘저어.
- 마 니 톨을 사용 하는 osmometer (단계 1.2.2에서에서 수행)와 290 mOsm/kg을 솔루션을 조정 합니다.
- 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 L-15 매체의 살 균 여과 수행 합니다.
- 살 균 여과 후 페니실린의 50 U/mL 및 50 µ g/mL 스에 해당 하는 페니실린 스 솔루션의 2.5 mL를 추가 합니다.
- 50 mL (0.1%) 트립 신 유형 II-S (단계 1.2 준비) 수정된 dPBS에 녹아의 1 mg/mL를 사용 하 여 트립 신 솔루션의 준비. 살 균 플라스틱 튜브에 2ml의 aliquots를 만들고 사용까지-20 ° C에서 저장.
참고: Aliquots 2 mL의 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 3 개월 이상. - 1 mg/mL (0.1%) 트립 신 억제 물 유형 I-S의,를 사용 하 여 트립 신 억제제 솔루션 50 mL를 준비 하 고 (단계 1.2 준비) 수정된 dPBS에서 해산 하는 DNase의 2 µ g/mL와 함께 그것을 보완. 살 균 플라스틱 튜브에 2ml의 aliquots를 만들고 사용까지-20 ° C에서 저장.
참고: Aliquots 2 mL의 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 3 개월 이상.
2입니다. 장비 준비
- 셀 분리에 대 한 팁을 연마 하는 불에 의해 유리 펫을 준비 합니다. 2 다른 크기 범주와 팁을 확인 (0.6-0.8의 중간 오프닝 µ m 및 0.4-0.6의 작은 개통 µ m) 동시에 피펫으로 선회 하면서 시간과 거리는 불꽃에서 재생 하 여. 넣어 유리 펫 깨끗 한 유리 용기에 압력솥 (모드를 사용 하는 고체 105 ° C에서 45 분).
- 얼음으로 폴리스 티 렌 상자를 준비 합니다.
- 해 부 동안에 pituitaries를 전송 하 고 얼음에 유지 1.5 mL (단계 1.2 준비) 수정된 dPBS의 플라스틱 튜브를 준비 합니다.
- (단계 1.2 준비) 수정된 dPBS의 10 mL 15 mL 튜브를 준비 하 고 셀 분리까지 얼음에 그것을 유지.
- 신선한 준비 또는 트립 신, 트립 신 억제제 솔루션 (1.4와 1.5 단계에서 준비)의 aliquots를 해 동 하 고 사용까지 얼음에 그들을 유지.
- pituitaries의 화학 분리 하기 전에 원하는 온도 도달 물 수 있도록 해 부를 시작 하기 전에 26 ° C에 물 목욕을 설정 합니다.
- 전에, 하는 동안, 그리고 물고기를 고정 해 부 및 정밀한 바늘 및 왁 스 격판덮개에 사용할 미세 집게를 포함 한 사용 후 70% 에탄올과 모든 해 부 도구를 청소 합니다. 깨끗 한 장갑을 사용 (변경 하 고 자주 청소) 셀의 잠재적인 오염을 방지 하는 전체 절차 동안.
3. 뇌 해 부 및 세포 분리
- 얼음 비 자금 (0 ° C)에 그것을 immersing 하 여 물고기를 안락사. 돌이킬 수 없는 저체온증이 충격을 위해 적어도 1 분 동안 얼음 비 자금에서 물고기를 둡니다.
참고: 몇 초 후 동원 정지 및 평형 손실이 발생할 것입니다. 생선과 얼음 물에 완전히 빠져들은 거짓말을 하지 않습니다, 얼음 위에 후자는 질 식으로 이어질 것입니다 하 고 잠재적인 피부 화상을 신속 하 고 자비 롭 저체온증이 충격 대신 다는 것을 확인 하십시오. - 신속 하 게 그물에 물고기 해 부 현미경 아래 왁 스 격판덮개 전송 하 고 목을 통해 바늘 펀치 척추를 파괴.
- 안정 해 부 하기 전에 머리 (뇌)의 뒤에 머리의 각 측에 (입)을 통해 전면에 한 바늘을 삽입 하 여 미세한 바늘을 사용 하 여 왁 스 격판덮개에 물고기의 머리 핀.
- 해 부 현미경 아래 물고기 하 고 부드럽게 직각된 팁과 미세 집게를 사용 하 여 머리의 상단에 비늘을 긁어.
- 신중 하 게 머리의 측면에서 피부 아래 좋은 집게의 각된 끝을 삽입 하 고 집게 포함 두개골 지붕에 확고 한 그립을 잡고 있는 동안 입의 방향에는 집게를 천천히 움직여서 두개골 지붕 제거.
- 잘라 척수 완전히 직각된 팁과 집게를 사용 하 여.
참고: 시간 효율적으로 중요 한 요소, 그래서 작업 이다 고 정확 하 게 제한 시간을 보냈다는 pituitaries의 해 부에서 세포는 접시에 도금 될 때까지. 일부 연습 후 뇌 해 부 10 주위 에서만 있는 물고기, 당 약 2-3 분 소요 됩니다 s 두뇌는 이미 노출 될 경우는 뇌 하 수 체를 선택 하는 데 필요한. - 신중 하 게 노출 하는 뇌 하 수 체 고 스트레이트 팁으로 깨끗 한 겸으로 해 부 입으로 뇌를 플립. 플라스틱 튜브 1.5 mL 수정 dPBS를 포함 하는 뇌 하 수 체 전송 (자세한 단계 2.3 참조) 얼음에. 하는 뇌 하 수 체 튜브에 성공적으로 추가 되 고 아무것도 집게에 남아 현미경 집게의 끝을 확인 하십시오.
참고: 문화 요리 준비를 동시에는의 수에 따라 필요에 따라 많은 pituitaries를 해 부. 엄지손가락의 규칙으로 서 성인 생선 접시 (다운스트림 응용 프로그램에 따라 달라 집니다)는 세포의 적절 한 밀도를 당 적어도 10 pituitaries를 계산 합니다. - 실 온에서 1-2 대 한 탁상 원심 분리기에서 pituitaries 아래로 회전 합니다. 조심 스럽게 dPBS 유리 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 모든 pituitaries를 제거 하지 않도록 주의.
- 씻어는 pituitaries, 1-2 s, 탁상 원심 분리기에서 스핀 다운 trypsin 솔루션의 추가 1 mL을 추가 하기 전에 유리 피 펫을 사용 하 여 액체의 대부분을 제거 (단계 1.4에서에서 준비) trypsin 솔루션의 1 mL를 추가 합니다.
- 가령, 부드러운 떨고, 30 분, 26 ° C에서 물 욕조에 튜브를 품 어 또는 양자 택일로, 영화 튜브 몇 번 인큐베이션 기간 동안.
- 실 온에서 1-2 대 한 탁상 원심 분리기에서 pituitaries 아래로 회전 시키십시오 그리고 모든 pituitaries 튜브의 하단에 위치 하 고 있는지 확인 하십시오. 유리 피 펫과 트립 신 솔루션의 대부분을 제거 하 고는 트립 신을 비활성화 하는 pituitaries 세척 트립 신 억제 물 솔루션 (1.5 단계에서 준비) 1 mL를 추가 합니다.
- 실 온에서 1-2 대 한 탁상 원심 분리기에서 그들을 아래로 회전 하 여 튜브의 하단에 pituitaries를 수집 합니다. 유리 피 펫과 액체의 대부분을 제거 하 고 트립 신 억제 물 솔루션 (1.5 단계에서 준비) 1 mL를 추가 합니다. 부드러운 떨고, 가령 20 분 26 ° C에서 물 욕조에 튜브 또는 양자 택일로, 영화 튜브 몇 번 비활성화는 트립 신을 인큐베이션 기간 동안.
- L-15 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 셀을 도금 하기 전에 적당 한 온도 pH 도달할 수 있도록 1% CO2 와 26 ° C에 적어도 10 분 동안 품 어 하 여 중앙 유리 바닥 35 m m 폴 리 d lysine 코팅 셀 문화 접시를 준비 합니다.
참고: 플라스틱 셀 문화 접시 사용할 수도 있습니다. 중앙된 유리 바닥 접시를 사용 하 여의 주요 장점은 셀 도금은 지역 이다 더 작은, 따라서, 적은 뇌 세포는 접시 당 필요. 일부 다운스트림 응용 프로그램 또한 유리 하단 (즉, 일부 이미징 기법)을 요구할 수 있습니다. - 기계적 분리를 시작 하기 전에 원하는 온도 도달할 수 있도록 4 ° C에 15 mL 튜브에 대 한 냉각 원심 분리기를 설정 합니다.
- 수집 회전 하 여 튜브의 하단에 pituitaries 실 온에서 1-2 대 한 탁상 원심 분리기에서 (에서 단계 3.11) 트립 신 억제제 솔루션 튜브 및 모든 pituitaries 전에 튜브의 하단에 위치 해 있는지 확인 신중 하 게 유리 피 펫을 사용 하 여 트립 신 억제제 솔루션의 대부분을 제거 합니다.
참고: 다음의 모든 단계에서 층 류 벤치 (LAF) 프로토콜 셀의 오염을 피하기 위하여 셀 작업에 대 한 인증을 수행 합니다. - 뇌 조직 조각 (단계 2.4에서에서 준비) 얼음 수정된 dPBS의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 불 광택 유리 피 펫 (단계 2.1에서에서 준비)에서 (x 6-7) 위아래로 조직 조각을 빨 아.
참고: 온도 필수적인 측면, 그래서 4 ° c.에 모든 솔루션을 유지 이 시점에서 앞으로, 가능 하면 얼음에 모든 단계를 수행 합니다. - 실 온에서 1-2 대 한 탁상 원심 분리기에서 조직 조각을 아래로 회전 시키십시오 그리고 신중 하 게 얼음에 새로운 15 mL 튜브에 해리 셀 (거의 1 mL)을 포함 하는 dPBS의 위쪽 부분을 전송. 튜브의 바닥으로 피 펫 조직 조각 남아 있습니다 이동 하지 마십시오.
- 단계 3.16-3.17 dPBS의 모든 10 mL 사용 될 때까지 한 번에 셀 차가운 dPBS의 1 mL에 해리를 반복 합니다. (추가 하는 dPBS의 마지막 3-4 mL)에 대 한 분리의 중소 열고 스위치를 끝으로 더 작은 개통을 가진 유리 피펫은와 유리 피 펫을 사용 하 여 시작 합니다. 여전히 표시 되는 경우 조직 조각 분리 프로시저의 끝으로 분리, 대 dPBS 2 마지막 단계 쪽으로 약 10 배를 pipetting 증가 하 고 마지막으로 잔여 조직 조각을 남겨두고. 부드럽게 셀 resuspend 그리고 거품의 표면에 셀 연결 셀 손상 발생할 수 있습니다으로 거품을 만들지 마십시오.
참고:이는 이 프로토콜의 중요 한 단계 이며 좋은 결과 달성 하기 위해 몇 가지 훈련이 필요 합니다. - 원심 분리기 (4 ° C에 냉각 된 사전)에 4 ° c.에서 10 분 동안 200 x g 에서 셀 아래로 회전 튜브를 균형 셀 펠 릿 것 튜브의 측면 표시 되었는지 확인 합니다.
- 원심 분리기에서 튜브를 조심 스럽게 제거 하 고 부드럽게는 원심 분리 후 직접 유리 피 펫과 상쾌한 빈 15 mL 플라스틱 튜브에 전송. 상쾌한의 대부분을 제거 하지만 작은 (수시로 보이지 않는) 셀 펠 릿 손실 되지 않도록 주의 해야 합니다.
- 조심 스럽게 L-15 문화 매체의 50-100 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend.
참고:이 단계에서 가능 하다는 셀의 개수 및 생존 능력 테스트 (예: 셀 trypan 블루는 hemocytometer를 사용 하 여 존재 계산), 하지만 주의 세포 현 탁 액의 일부를 사용 하 여이 목적에 대 한 수익률을 낮출 것 이다. 로 셀 접시의 센터 외부 확산의 위험을 증가 시킬 것 이다 큰 서 스 펜 션의 볼륨을 사용 하지 마십시오. - 조심 스럽게 L-15 매체 (준비 단계 3.13에서에서)의 2 개 mL를 포함 하는 셀 문화 접시 중간에 해리 셀 똑. 유리 바닥의 오목 부분 외부 확산 셀 것을 피하기 위해 인큐베이터에 그들을 이동 하기 전에 약 5 분 동안 접시의 바닥에 침 몰에 셀 수 있습니다.
- 철저 하 게 침 몰 하 고 접시의 바닥에 연결을 모든 셀 수 있도록 26 ° C와 1% CO2 접시를 품 어.
- 30 분 후 그들은 문화 접시에 첨부 되도록 현미경에서 세포를 봐.
- 26 ° C와 1% CO2에서 셀을 품 어를 계속 합니다.
- 신중 하 게 변경의 대부분 (전부는 아니지만) 보통 3-4 일 마다.
참고: 셀을 방해 하 고 있도록 유리 바닥에서 분리 수 있습니다 매체를 더 자주 변경 하지 마십시오. 실험에 대 한 셀을 사용 하 여 그들을 뿌리기 후 1 주일 이내.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 프로토콜 메 다카 pituitaries에서 기본 세포 배양의 준비를 설명 하 고 최소한 1 주일에 대 한 문화에서 유지 될 수 있는 건강 한 세포를 제공 한다. 프로토콜 메 다카14 생리 관련 값을 기반으로 하며 또한 성인 물고기는 도금을 수확 하는 조직에서 전체 절차 동안 7.75의 pH 및 290 mOsm/kg의 osmolality를 사용 하 여 뇌 조직에 최적화 된 (그림 1 및 그림 2) 문화에 셀.
이 프로토콜에 의해 생성 하는 기본 세포 배양 실험에서 대표적인 결과 그림 3, 그림 4및 그림 5에 표시 됩니다. 여기에 제시 된 결과 대 한 유전자 변형 메 다카 라인, luteinizing 호르몬 (Lh) 어디-gonadotrope 세포, 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 사용19. 그림 3 은 대표적인 필드 시드, 후 7 일에 하루 0에서에서 기본 세포 배양 접시에 모두 밝은 분야 및 형광 현미경 이미지를 포함 하 여 GFP 표현 Lh gonadotrope 셀 표시. 보통 접시 당 약 10 성인 메 다카 pituitaries를 사용 하 여 시드 후 접시 당 1 x 105 셀 주위 5 x 104 -의 밀도 결과. 문화에 있는 뇌 세포의 생존 능력 0 (그림 4)에 비해 1, 3, 및 도금, 후 7 일에 문화에 GFP 표현 세포의 총 수에 따라 계산 됩니다. 그림 4 에 표시 된 그래프 이상 90%는 3 일 후 아직 살아있다 면 죽어가는 세포 수가 거의 1 일 후 세포의 95% 이상 시간이 경과 해도 일정 임을 나타냅니다. 시간 세포 생존 능력에 있는 작은 감소는, 대부분의 세포 (약 75%) 문화에 주 후에 아직도 살아 있습니다. (Strandabø, 외.에 설명 된 대로 수행) Lh-gonadotrope GFP 표현 세포의 electrophysiological 녹음 20이 보여줍니다 셀 문화 (그림 5A)에서 4 일 후에 저절로 활동 전위를 불 수 있습니다. 또한, 생식 샘 자극 호르몬-방출 호르몬의 자극에 따라 세포 막의 초기 과도 hyperpolarization 다음 도발 및 행동의 증가 기간으로 수 반하는 주파수를 발사에 극적인 증가 전위 (그림 5B)입니다.
그림 1: 뇌 주 세포 문화 기술의 개요. Pituitaries 고급 포 셉으로 해 부하 고 트립 신 억제제와 비활성화 뒤 26 ° c (2 단계), 트립 신으로 pituitaries의 효소 소화까지 수정된 dPBS 얼음 (프로토콜의 1 단계)를 포함 하는 플라스틱 튜브로 전송 에 26 ° C (표시 되지 않음). 유리 피 펫과 소화 효소 pituitaries의 기계적 분리 dPBS 얼음 (3 단계)에 4 ° C (4 단계)에서 원심 분리 뒤에 신중 하 게 수행 됩니다. 마지막으로, 셀 펠 릿 문화 매체와 셀 문화 접시 (5 단계)에서 밖으로 도금 하는 셀에 녹입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 메 다카 뇌 해 부의 세부 사항. (A)는 고정된 메 다카 (지 보기)의 머리 왁 스 플레이트에 고정 되어 있고 두개골 지붕 위쪽 뇌의 상단 노출 미세 집게로 제거 됩니다. (B) 척수를 절단 하 고는 뇌 하 수 체는 노출 된 뇌 머리의 앞쪽 뒤집혀. (C)는 뇌 하 수 체는 깨끗 하 고 괜 찮 아 요 집게와 함께 수집 됩니다. B 와 C화살촉 패널에서 뇌 하 수 체를 가리킵니다. 눈금 막대 = 1000 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 메 다카 하 1 차 셀 문화. 이러한 패널 하루 0, 3, 일 및 시드 후 7 일에 대표 메 다카 하 기본 세포 배양의 고해상도 confocal 이미지를 표시합니다. 상단 패널 중간 패널에 보기의 동일한 필드 표시 GFP 표현 Lh gonadotrope 셀의 형광 현미경 이미지 표시 하 고 하단 패널은 두의 오버레이 접시에 대표적인 필드의 밝은 분야 현미경 이미지를 보여줍니다. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 메 다카 뇌 하 수 체의 세포 문화. 이 그림에 0, 1, 3 및 7 일 시드 후에 측정 하 기본 세포 배양의 가능성입니다. 숫자는 CellProfiler V2 오픈 소스 소프트웨어를 사용 하 여 계산 하 고 시간 0에 비해 다른 시간 지점에서 접시 당 GFP 표현 Lh gonadotrope 세포의 총 수를 기준. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 뇌 세포의 Electrophysiological 녹음. 이러한 패널 기본 세포 배양 후 시드, (A) 자발적인 활동 전위의 대표적인 흔적을 보여주는 (B) 주 4에서 수행 electrophysiological 녹음 GFP 표현 Lh gonadotrope 셀에서 표시 한 10 대 한 생식 샘 자극 호르몬-방출 호르몬 Gnrh1 자극 s. Gnrh1 자극 유도 hyperpolarization 도발은 및 증가 (50% 피크에서 측정 되는) 활동 전위 기간 세포 막의 복 형 응답 8.9 ±에서 자극 하기 전에 3.0 ms 29.2 ±를 후 9.9 ms는 자극입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
체 외에서 세포 배양 시스템 연구자 올바른 방법1에서 사용 하는 경우 다른 생물학 질문의 과다 한 답변에 대 한 강력한 도구를 제공 합니다. 그것은 그 해리 셀 인접 셀에 그들의 연결을 잃 었 수 있습니다 얻은 다른 기능 속성 보다 그들은 원래 에 비보를 기억 하는 것이 중요. 위험에 생체 외에서 실험에서 얻은 결과 잘못 해석 되 고 피하기 위해, 그것은 고려의 종 및 셀 형식에 기본 셀 문화 절차를 조정 하는 것이 중요. 심지어 중간 조정 표준 문화 절차와 사용 되는 솔루션의 뿌리깊은 특정 셀 형식의 문화 조건을 변경할 충분 한 많습니다.
이 프로토콜 최적화 된 조건을 준비 하 고 유지 하는 솔루션의 온도, osmolality, pH, 및 pCO2 사용을 매개 변수를 조정 하 여 달성 될 수 있는 성인 메 다카 pituitaries에서 1 차 셀 문화에 대 한 설명 이 종의 생리 적 조건 일치. PH 의존 온도 이며, 따라서, 또한을 조정 해야 teleost 물고기 다른 온도17에 생활의 다른 종 사이. 세포 분리 및 배양 시 사용 되는 모든 솔루션의 osmolality 셀의 상태를 개선 하기 위해 또한 조정 한다. 특히, 거기에 불일치 osmolality 격리 절차 중 사용 하는 다른 솔루션 사이, 감소 가능성 (작가 자신의 되지 않은 결과)로 이어지는 문화 품질에 치명적인 영향을 있을 수 있습니다. Hyperosmotic 솔루션은 세포를 축소 (와 반대로), 멤브레인과 막 단백질 기능21방해 함으로써 발생 합니다. 이 컨텍스트에서 중요 한 점은 osmolality pH 등의 매개 변수는 일반적으로 측정도 안정적인 상업 버퍼의 다른 배치와 포유류 문화 조건에 사용 된 문화 미디어 사이. 차이 osmolality pH 사이의 격리 절차 중 사용 하는 다른 솔루션 항상 피해 야 한다.
이 프로토콜의 훈련에 의해 향상 됩니다, 그리고 연구자 기술의 다른 단계에 익숙해질 시간이 좀 필요 예상 된다 그래서. 예를 들어, 셀 건강 세포는 접시에 도금 될 때까지 pituitaries의 절 개에서 시간 관련 반비례. 유리 피 펫을 사용 하 여 pituitaries의 기계적 분리 프로토콜의 특히 중요 한 단계 이며, 그것은 좋은 결과 달성 하기 위해 몇 가지 훈련이 필요 합니다. 분리 절차는 유해한 세포 삼 투 및 기계적 스트레스를 발생할 수 있습니다. 기계적 분리에 대 한 반복된 단계 수정된 dPBS의 작은 볼륨의 추가 연구를 계속 하는 동안 이미 해리 셀 새로운 튜브와 손길이 닿지 않은, 왼쪽으로 전송 됩니다 gentler 분리 절차 보장 추가 셀 dPBS의 새로운 볼륨에 조직에서 해리
이 프로토콜은 성인 메 다카 뇌 세포에 최적화 되어 있습니다. 종, 조직, 또는 동일한 조직 내에서 동물의 다른 생활 단계 문화 조건의 최적화 필요합니다. 예를 들어, 미 성숙한 동물에서 얻은 세포 더 취약 있을 수 있습니다 그리고, 그러므로, apoptosis를 향해 더 취약 세포 죽음 및, 따라서, gentler 분리 절차 향해 특히 프로토콜을 조정 하는 필요 할 거 수 있습니다. 유리 피 펫을 사용 하 여 기계적 분리 절차의 매우 중요 한 단계는 너무 조심 기계적 분리 너무 거친 한 apoptosis 및 세포 죽음을 유도 수 있습니다 하는 동안 낮은 이득으로 이어질 것입니다. 다른 효소는 분리에 대 한 간주 됩니다, 만약 다른 소화 시간과 효소 농도 사용 해야 할 수 있습니다. 메 다카 pituitaries 아주 작은 있으며 상대적으로 쉽게 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 분리. 그러나, 다른 종족에 대 한 최적화 파편 제거를 분리 후 메쉬 필터를 사용 하 여가 필요할 수 있습니다. 이 프로토콜의 성공 또한 셀 오염 방지 무 균 조건 아래 단계를 수행에 따라 달라 집니다.
접시 당 씨앗에 셀 수 시작에, pituitaries의 수로 분리 절차의 성공에 따라 달라 집니다. 약 그대로 성인 메 다카 뇌 하 수 체에서 약 15, 000 셀이 있습니다. 그러나, 세포 분리 과정에서 손실 되 고 pituitaries는 실험에 필요한 수를 계산할 때이 대 한 설명 되어야 한다. 접시 당 적어도 10 pituitaries를 사용 하 여 일반적으로 귀 착될 것 이다 주변의 밀도 접시 당 50000-100000 셀. 이 밀도에서 집계는 형성 하지 상당한 금액에 문화에서 7 일 후에. 눈에 띄게, 집계 인 것을 보인다 종속, 밀도 농도 세포는 시드, 그들은 더 많은 것을 집계. 특정 절차 밀도가 문화를 필요로 할 수 있고, 따라서, 최적의 시드 밀도 다운스트림 응용 프로그램에 따라 고려해 야 합니다. 그것은 고려의 pituitaries 수를 계획할 때 요리 당 사용 하는 중요 한 포인트입니다.
가장 일반적인 다운스트림 응용 프로그램 1 차 셀 문화를 사용 하 여 시드 후 처음 몇 일 이내. 여기 electrophysiological 녹음 세포 생존 능력에서 제시 하는 결과 시드 후 최대 1 주일에 대 한 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 준비 하는 1 차 셀 문화에서 좋은 결과 얻을 수 있다는 표시. 그럼에도 불구 하 고, 문화, 더 이상 유지 될 수 있습니다 그리고 건강 한 세포는 문화 (저자 자신의 되지 않은 결과)에서 2 주 동안 후 여전히 존재. 이 프로토콜에 최적화 된 조건을 생리학적으로 의미 있는 결과 용이 하 게 하 고 비 포유류 세포에서 1 차 셀 문화를 준비 하는 다른 과학자에 대 한 도움이 될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 선언할 수 없다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 생명과학과 연구 노르웨이 위원회, 부여 번호 243811 및 244461 (양식 프로그램)의 노르웨이 대학에 의해 투자 되었다. 우리는 물고기 시설을 유지 하기 위한 생명 공학의 노르웨이 대학에서 루르 드 Carreon 탄을 감사입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D8537 | Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol. |
| L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | L5520 | Supplement 500 ml culture medium with 10 mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 mL Penicillin-Streptomycin solution (see below for details). |
| NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5881 | Add drops of 1 M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75. |
| NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5761 | 10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 mL culture medium. |
| D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | 63565 | Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm. |
| D-glucose | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | G5400 | 4.5 mM D-glucose equals 405 mg per 500 mL culture medium. |
| GlutaMAX Supplement | Gibco (Life Technologies, Paisley, UK) | 35050-061 | Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100x stock in 500 mL culture medium. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | P0781 | Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 mL of stock solution in 500 mL L-15 medium (equivalent of 50 U/mL Penicillin and 50 µg/mL Streptomycin). |
| Trypsin type II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T7409 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution. |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T6522 | Prepare 1 mg/mL in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below). |
| Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D5025 | Use in trypsin inhibitor solution (see above). |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments. |
| 35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application. |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11254-20 | Straight tip |
| Dumont #5/45 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11253-25 | Angled 45° tip |
| Stereo microscope SZ61 | Olympus Corp. (Tokyo, Japan) | Use for dissection of pituitaries. | |
| Alegra X-22R Centrufuge | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | With cooling option (similar to current model XR-30). | |
| Water bath | Techne (Staffordshire, UK) | Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do. | |
| Pasteur glass pipettes | VWR (NY) | 612-1701 | Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use. |
| Galaxy MiniStar table centrifuge | VWR (NY) | 521-2844 | Any small table centrigue will do. |
| Fine needles/insect pins | Fine Science Tools (CA) | 26001-40 | Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead. |
| Wax plate | Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish. |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
- Ribeiro, L. P., Ahne, W. Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells from carp (Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro. In Vitro. 18 (5), 419-420 (1982).
- Ribeiro, L., Ahne, W., Lichtenberg, V. Primary culture of normal pituitary cells of carp (Cyprinus carpio) for the study of gonadotropin release. In Vitro. 19 (1), 41-45 (1983).
- Wong, A. O., Ng, S., Lee, E. K., Leung, R. C., Ho, W. K. Somatostatin inhibits (d-Arg6, Pro9-NEt) salmon gonadotropin-releasing hormone- and dopamine D1-stimulated growth hormone release from perifused pituitary cells of chinese grass carp, Ctenopharyngodon idellus. General and Comparative Endocrinology. 110 (1), 29-45 (1998).
- Chang, J. P., et al. Use of a pituitary cell dispersion method and primary culture system for the studies of gonadotropin-releasing hormone action in the goldfish, Carassius auratus. I. Initial morphological, static, and cell column perifusion studies. General and Comparative Endocrinology. 77 (2), 256-273 (1990).
- Weil, C., Hansen, P., Hyam, D. Use of pituitary cells in primary culture to study the secretion in rainbow-trout - Setting up and validating the system as assessed by its responsiveness to mammalian and salmon gonadotropin-releasing hormone. General and Comparative Endocrinology. 62 (2), 202-209 (1986).
- Montero, M., LeBelle, N., Vidal, B., Dufour, S. Primary cultures of dispersed pituitary cells from estradiol-pretreated female silver eels (Anguilla anguilla L): Immunocytochemical characterization of gonadotropic cells and stimulation of gonadotropin release. General and Comparative Endocrinology. 104 (1), 103-115 (1996).
- Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
- Lin, S. W., Ge, W. Differential regulation of gonadotropins (FSH and LH) and growth hormone (GH) by neuroendocrine, endocrine, and paracrine factors in the zebrafish-An in vitro approach. General and Comparative Endocrinology. 160 (2), 183-193 (2009).
- Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO2, and pH. General and Comparative Endocrinology. 178 (2), 206-215 (2012).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far East. Nature Reviews Genetics. 3, 53-64 (2002).
- Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
- Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
- Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Letters. 2 (12), (2016).
- Waymouth, C. Osmolality of mammalian blood and of media for culture of mammalian cells. In Vitro. 6 (2), 109-127 (1970).
- Cameron, J. N. Acid-base homeostasis - past and present perspectives. Physiological Zoology. 62 (4), 845-865 (1989).
- Claiborne, J. B., Edwards, S. L., Morrison-Shetlar, A. I. Acid-base regulation in fishes: cellular and molecular mechanisms. Journal of Experimental Zoology. 293 (3), 302-319 (2002).
- Perry, S. F., Tufts, B. L. Fish respiration. , Academic Press. San Diego, CA. (1998).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone β-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Strandabø, R. A. U., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Molecular and Cellular Endocrinology. 372 (1-2), 128-139 (2013).
- Verbalis, J. G. Brain volume regulation in response to changes in osmolality. Neuroscience. 168 (4), 862-870 (2010).
