Summary

Gentranskription durch Umleiten zellulären Maschinerie mit chemischen epigenetische Modifikatoren zu unterdrücken

Published: September 20, 2018
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Summary

Verordnung der Chromatin-Umgebung ist ein wesentlicher Prozess erforderlich für die ordnungsgemäße Genexpression. Hier beschreiben wir eine Methode zur Steuerung der Genexpression durch die Rekrutierung von Chromatin-modifizierende Maschinen Gen-spezifischen und reversibel.

Abstract

Regulierung von Chromatin Verdichtung ist ein wichtiger Prozess, der Gen-Expression in den höheren Eukaryotes regelt. Obwohl Chromatin Verdichtung und Genregulation Ausdruck allgemein bei vielen Krankheiten gestört werden, hat eine Locus-spezifische, endogene und reversible Methode zu studieren und steuern diese Wirkmechanismen gefehlt. Um dieses Problem zu beheben, haben wir entwickelt und neue gen-regulierende bifunktionelle Moleküle gekennzeichnet. Ein Bestandteil der bifunktionelle Molekül bindet an ein DNA-Protein-Anker, so dass es zu einem Allel-Spezifische Locus eingestellt werden. Die andere Komponente greift körpereigene zelluläre Chromatin-modifizierende Maschinen, Rekrutierung dieser Proteine zu einem gen des Interesses. Diese kleinen Moleküle, genannt chemischen epigenetische Modifikatoren (CEMs), sind in der Lage, Genexpression und die Chromatin-Umwelt in einer Dosis-abhängigen und reversible Weise zu kontrollieren. Hier zeigen wir ein CEM-Konzept und seine Anwendung auf die Genexpression und Histon Schweif Acetylierung auf ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) Reporter am Oct4 Locus in embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) zu verringern. Wir charakterisieren die Führung CEM (CEM23) mit Fluoreszenz-Mikroskopie, Durchflusszytometrie und Chromatin Immunopräzipitation (ChIP), gefolgt von einer quantitativen Polymerasekettenreaktion (qPCR). Während die Kraft dieses Systems auf die Oct4 Locus, konzeptionell nachgewiesen wird, die CEM-Technologie ist modular aufgebaut und kann in andere Zelltypen und an anderen genomic Loci angewendet werden.

Introduction

Chromatin besteht aus DNA umwickelt Octamer histonproteine, die das Kern-Nukleosom-Teilchen bilden. Regulierung von Chromatin Verdichtung ist ein wesentlicher Mechanismus für korrekte DNA-Reparatur, Replikation und Ausdruck1,2,3. Ein Weg in die Zellen der Verdichtung zu kontrollieren ist durch das Hinzufügen oder Entfernen von verschiedenen Post-translationalen Histon-Tail-Modifikationen. Zwei solche Modifikationen umfassen (1) Lysin Acetylierung, die am häufigsten im Zusammenhang mit Genaktivierung ist, und (2) Lysin-Methylierung, die Genaktivierung oder Unterdrückung, je nach Aminosäure Kontext zugeordnet werden können. Die Zugabe der Acetylierung und Methylierung Marken ist von Histon-Acetyltransferases (Hüte) und Histon-Methyltransferasen (HMTs), bzw. katalysiert, während die Entfernung der Marke durch Histon Deacetylases (HDACs) und Histon-Demethylases (HDMs erfolgt ), bzw.4,5. Obwohl die Existenz dieser Proteine ist seit Jahrzehnten bekannt, viele Mechanismen wie Chromatin-modifizierende Maschinen arbeitet, um richtig Genexpression regulieren noch festgelegt werden. Da Chromatin Regulationsprozesse Dysregulated bei vielen menschlichen Krankheiten sind, könnten zukünftige therapeutische Anwendungen neue mechanistische Einblicke.

Der Chromatin in Vivo Assay (CiA) ist eine kürzlich beschriebenen Technik, die eine chemische Induktor von Nähe (CIP) verwendet, um Chromatin-modifizierende Maschinen Rekrutierung Steuern zu einem bestimmten Locus-6. Diese Technologie wurde genutzt, um eine wachsende Liste von Chromatin Dynamik, einschließlich Histon-modifizierende Proteine, Chromatin Remodelers und Transkription Faktoren6,7,8,9zu studieren. CIP-basierte Chromatin Anbindehaltung von exogen exprimierten Proteine wurde auch vorbei an CiA nicht veränderten genetischen Loci zu modulieren mittels mit einem deaktivierten gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische wiederholt CRISPR-assoziierten Protein (dCas9) erweitert 10 , 11. im CiA-System mESCs wurden geändert, um eine GLP-Reporter-gen bei Oct4 Locus, ein höchst ausgedrückt und streng reglementierten Bereich des Genoms mESC zum Ausdruck bringen. Zuvor wurde dieses System um die dosisabhängig und reversible Rekrutierung von exogen ausgedrückt Heterochromatin Protein 1 (HP1), ein Enzym zu beschreiben, die bindet H3K9me3 und breitet sich repressive Markierungen (z.B.H3K9me3) angewandt und DNA Methylierung6. Um diese Art von Recruiting-Strategie zu erreichen, sind die mESCs mit einem Plasmid infiziert, die drückt eine FK506-bindendes Protein (FKBP) verbunden mit einem Gal4, die eine DNA-Protein-Anker, der an eine Gal4-Bindung Array stromaufwärts von der GFP-Reporter bindet. Die Zellen sind auch mit einem FKBP-Rapamycin-bindende Domäne (FRB) verbunden mit HP1 infiziert. Wenn die mESCs gering nanomolaren Konzentrationen des CIP ausgesetzt sind, Rapamycin, FRB und FKBP, zusammengeführt in den Target Locus. Innerhalb von Tagen von Rapamycin Behandlung Ausdruck des Zielgens wird unterdrückt, wie Fluoreszenz-Mikroskopie und Flow-zytometrie belegt und Histon Acetylierung sinkt, von ChIP und Bisulfit Sequenzierung gezeigt. Während die Entwicklung und Validierung dieses Ansatzes bedeutende Fortschritte auf dem Gebiet der Chromatin Forschung und Regulierung wurden, ein Nachteil ist die erforderliche exogene Ausdruck der Chromatin-modifizierende Maschinen.

Um die Technologie basiert auf Einstellung von nur endogene physiologisch relevanten Enzyme und machen einem modulares System, wir konzipiert und zeichnet sich neuartige bifunktionelle Moleküle, CEMs (Abbildung 1)12bezeichnet. Ein Bestandteil der CEMs umfasst FK506, die ähnlich wie Rapamycin, dicht und speziell bindet, FKBP. So werden der CEMs noch Oct4 Locus in der CiA-mESCs eingestellt werden. Die andere Komponente der CEMs ist eine Verbindungsgruppe, die endogenen Chromatin-modifizierende Maschinen bindet. In einer Pilotstudie getestet wir CEMs, die HDAC-Inhibitoren enthalten. Während das Konzept des Verwendens eines Inhibitors HDACs rekrutieren unlogisch erscheint, kann die Inhibitor dennoch HDAC-Aktivität, das Gen des Interesses zu rekrutieren. Dies geschieht durch (1) die HDAC umleiten auf Locus, Freigabe des Enzyms und Erhöhung der Dichte des UN-gehemmte HDACs in der Region und (2) die Aufrechterhaltung HDAC-Hemmung auf dem Lokus, aber Rekrutierung repressiven komplexe, die an die gehemmte HDACs binden, oder (3) eine Kombination aus beidem. In einer früheren Studie zeigten wir, dass die CEMs erfolgreich unterdrücken die GFP-Reporter in einer Zeit-dosisabhängige Weise, sowie in einer Weise konnten, schnell reversibel war (d. h.innerhalb von 24 Stunden)12. Wir zeichnen die Fähigkeit der CEM-Technologie präsentiert hier Kontrolle Genexpression mit Fluoreszenz-Mikroskopie, Durchflusszytometrie und die Fähigkeit, um mittels ChIP-qPCR6Chromatin-Umgebung zu kontrollieren. Hier beschreiben wir eine Methode für die Verwendung und Charakterisierung der CEMs, die die Anpassung des Systems für zusätzliche Fragen im Zusammenhang mit Chromatin Biologie erleichtern wird.

Protocol

(1) Linie Zellkultur zur Herstellung von Lentivirus Wachsen frische, niedrig-Passage (weniger als 30 Durchgang) 293T menschlichen embryonalen (HEK) Nierenzellen in hoch-Glukose Dulbecco modifizierten Eagle ist Medium (DMEM) base Medien ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 10 mM HEPES, 1 x nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), Stift / STREP, 2-Mercaptoenthanol in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2. Teilen Sie die Zellen jedes 3-5 d und zuvor werden sie > 95 % Zusammenfluss. Durch…

Representative Results

Wir vor kurzem CEMs entwickelt und gezeigt, dass diese Technologie zur Regulierung der Genexpression und Chromatin Umwelt an einen Ort der Reporter in einer Dosis-abhängigen und reversible Weise angewendet werden kann. In Abbildung 1ist ein Modell des potenziellen Kunden CEM, CEM23, dargestellt. HDAC-Maschinen ist, die Reporter-Locus von HDAC-Inhibitor rekrutiert, die in diesem Fall der GFP-Reporter an die Oct4 Locus eingefügt ist. <p class="jo…

Discussion

Hier beschrieben wir die neu entwickelte CEM-System zur Regulierung der Genexpression und Chromatin-Umgebung auf ein bestimmtes Gen in einer Dosis-abhängigen Weise angewendet wird. Wir bieten eine genaue Methode zur Untersuchung der Dynamik bei der Regulierung der Genexpression durch die gezielte Rekrutierung von bestimmten endogenen Chromatin regulatorische Proteine beteiligt. Dies ist eine sehr modulare Technologie, die angewendet werden können um zu untersuchen, wie verschiedene Protein – und Chromatin-modifizierend…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten die Hathaway und Jin Labors für ihre hilfreiche Gespräche danken. Die Autoren danken auch Dan Crona und Ian MacDonald für ihre kritischen Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt von Grant R01GM118653 von der US National Institutes of Health (zu N.A.H.); und durch Zuschüsse R01GM122749, R01CA218600 und R01HD088626 aus der US-National Institute of Health (, j.j.). Diese Arbeit wurde auch unterstützt durch eine Stufe 3 und ein Student aus dem UNC-Eshelman Institut für Innovation zu gewähren (N.A.H und A.M.C, beziehungsweise). Zusätzliche Mittel aus einem T-32-GM007092 (für A.M.C) unterstützt diese Arbeit. Flow Cytometry Daten wurde auf die UNC-Flow Cytometry Core Facility finanziert durch einen P30 CA016086 Cancer Center Core Support Zuschuss an die UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center erhalten.

Materials

DMEM Corning 10-013CV
NEAA Gibco 11140-050
HEPES (for tissue culture) Corning 25-060-Cl
BME (2-Mercaptoethanol) Gibco 21985-023
FBS Atlantic Biologicals S11550 Individual lots tested for quality
Covaris tubes ThermoScientific C4008-632R
Covaris caps ThermoScientific C4008-2A
PEI (polyethylenimine) Polysciences 23966-1
Transfection media (Opti-mem) Gibco 31985070
Virus centrifuge tubes Beckman Coulter 344058
Virus filter membrane Corning 431220
Polybrene Santa Cruz Biotechnology SC134220
0.25 % Trypsin Gibco 25200-056 with EDTA
0.05 % Trypsin Gibco 25400-054 with EDTA
Puromycin InvivoGen ant-pr
Blasticidin InvivoGen ant-bl
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) Roche 4913914001
H3K27ac antibody Abcam ab4729
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit Active Motif 53040
Sonicator Covaris E110
Ultracentrifuge Optima XPN-80
SW-32 centrifuge rotor Beckman Coulter 14U4354
SW-32 Ti centrifuge buckets Beckman Coulter 130.2
LentiX 293 Human Embryonic Kidney Clontech 632180
PBS Corning 46-013-CM
BSA Fisher BP9700
EGTA Sigma E3889
EDTA Fisher S311-100
NaCl Fisher S271-1
Glycerol Fisher G33-1
Tris Fisher BP152
NP40 Roche 11754599001
Triton MP Biomedicals 807426
Glycine Fisher BP381-500
TE buffer Fisher BP2474-1
HEPES (for ChIP) Fisher BP310-100
Gelatin Sigma G1890
Flow cytometer, Attune NxT Thermo Fisher A24858
FKBP-Gal4 plasmid Addgene 44245
psPAX2 plasmid Addgene 12260
pMD2.G plasmid Addgene 12259
Nanodroplets MegaShear N/A
DNA Nanodrop Thermo Fisher ND1000
Protease Inhibitors (Leupeptin) Calbiochem/EMD 108975
Protease Inhibitors (Chymostatin) Calbiochem/EMD 230790
Protease Inhibitors (Pepstatin) Calbiochem/EMD 516481
CiA:Oct4 mESC The kind gift of G. Crabtree
Lif-1C-alpha – producing Cos cells The kind gift of J. Wysocka

References

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Citer Cet Article
Chiarella, A. M., Wang, T. A., Butler, K. V., Jin, J., Hathaway, N. A. Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers. J. Vis. Exp. (139), e58222, doi:10.3791/58222 (2018).

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