化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制
Summary
クロマチン環境規制、適切な遺伝子発現に必要な重要なプロセスです。ここでは、クロマチン修飾の採用によって遺伝子発現を制御する手法について述べる遺伝子特異的かつ可逆的に機械。
Abstract
クロマチンの凝縮の規制は、高等真核生物における遺伝子発現を制御する重要なプロセスです。クロマチンの凝縮と遺伝子発現制御は通常、多くの病気で中断されたが研究し、アクションのこれらのメカニズムを制御する特定の軌跡、内因性、および可逆メソッドを欠いてきた。この問題に対処するため開発し、遺伝子調節塩基分子の特徴します。二官能性の分子の 1 つのコンポーネントは、対立遺伝子特定の遺伝子座に採用されるので、DNA タンパク質アンカーにバインドします。その他のコンポーネントは、内因性細胞クロマチン修飾機械装置、興味の遺伝子にこれらの蛋白質を募集を行っています。化学のエピジェネティックな修飾剤 (CEMs) と呼ばれるこれらの小さい分子は用量依存的かつ可逆的に遺伝子発現とクロマチン環境を制御することが可能です。ここでは、我々 は CEM アプローチと遺伝子の発現とマウス胚性幹細胞 (mESCs) のOct4遺伝子座にある緑色蛍光タンパク質 (GFP) 記者でヒストンの尾のアセチル化を減少への応用を詳しく説明します。我々 はリードを特徴付ける CEM (CEM23) 蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、クロマチン免疫沈降 (チップ) を使用して量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) 続きます。概念的には、 Oct4遺伝子座でこのシステムの力を発揮しながら、CEM 技術はモジュール化され他の細胞型、他のゲノムの遺伝子座に適用できます。
Introduction
クロマチンは、DNA は、ヌクレオソーム粒子を形成するヒストン八量体タンパク質を包んだので構成されます。クロマチンの凝縮の規制は、適切な DNA 修復、レプリケーション、および式1,2,の3重要な仕組みです。細胞が圧縮のレベルを制御する方法の 1 つはまた、さまざまな翻訳後修飾ヒストンの尾の除去です。このような 2 つの変更には、遺伝子の活性化に最もよく関連付けられる (1) リジンのアセチル化と遺伝子の活性化や抑制、アミノ酸コンテキストに応じて関連付けることができます (2) リジンのメチル化が含まれます。アセチル化とメチル化マークの追加により触媒されるヒストン コリンアセチルトランスフェラーゼ (帽子) およびヒストンのメチル基転移酵素 (HMTs)、それぞれがマークの除去はヒストン脱アセチル化酵素 (Hdac) とヒストン脱メチル化酵素 (焦点によって行われます)、それぞれ4,5。これらの蛋白質の存在が知られていた何十年も、多くのメカニズムを定義するどのクロマチン修飾機械の遺伝子発現を適切に規制する作品が残っています。クロマチン規制プロセスは多くの人間の病気の調節不全なので新しい力学的洞察の将来の治療への応用に 。
アッセイ体内クロマチン (CiA) は、特定の軌跡6機械募集のクロマチン修飾を制御する近接 (CIP) の化学誘導を使用して最近説明手法です。この技術は、タンパク質のヒストン修飾、クロマチンの remodelers トランスクリプション要因6,7,8,9などのクロマチン動態の拡大のリストを勉強する使用されています。Cip 法に基づいたクロマチンが外に表現された蛋白質のテザリングもによって拡張されている過去の非変更された遺伝子座を調節する CiA 非アクティブ クラスター化定期的に空間短い回文を繰り返す CRISPR 関連タンパク質 (dCas9) で使用10,11. Oct4遺伝子座、mESC ゲノムの高発現と厳しく規制された地域で GFP レポーター遺伝子を表現する CiA システムの mESCs が変更されました。外に表明したヘテロクロマチン蛋白質 1 (HP1)、H3K9me3 を結合し、抑圧的な印 (例えばH3K9me3) を伝達酵素の用量依存的かつ可逆的な募集を記述するこのシステムが適用された以前は、DNA とメチル化6。このタイプの募集戦略を達成するために、mESCs は GFP レポーターの上流 Gal4 結合配列に結合する DNA タンパク質アンカーの Gal4 にリンク FK506 結合タンパク質 (FKBP) を表現するプラスミッドに感染しています。セルは HP1 に接続 FKBP ラパマイシン結合ドメイン (FRB) にも感染しています。MESCs は、CIP の低ナノモル濃度にさらされれば、ラパマイシン、FRB と FKBP、ターゲット遺伝子座で一緒に取り込まれます。ラパマイシン標的治療の日、ターゲット遺伝子の発現が抑制され、蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーによって証明されるよう、ヒストンのアセチル化を減少すると、チップと重亜硫酸塩の配列によって示されています。開発とこのアプローチの妥当性クロマチン研究と規制の分野で重要な進歩をされている、1 つの欠点はクロマチン修飾の外因性表現が求められる機械。
内因性の生理学的に関連した酵素のみの募集に基づく技術よりモジュラー システムの設計し、CEMs (図 1)12と呼ばれる塩基分子の特徴します。CEMs の 1 つのコンポーネントが含まれますラパマイシンのようしっかりと具体的にバインド FK506 には FKBP に。したがって、CEMs は CiA mESCs Oct4遺伝子座には募集まだ。CEMs の他のコンポーネントは、内因性クロマチン修飾機械を結合する部位です。パイロット研究では、CEMs HDAC の抑制剤が含まれているをテストしました。Hdacs をしたを募集する阻害剤を使用してのコンセプトは直感に反するようだ、阻害物質は興味の遺伝子に HDAC 活動を募集することができるそれにもかかわらず。これは、(1)、酵素を解放エリアに位置し、座 (2) 維持する HDAC 阻害 hdacs を非抑制したの密度を増加させ、バインド hdacs を抑制した抑圧的な複合体を採用、軌跡へ、HDAC のリダイレクトで(3)、または両方の組み合わせ。以前の研究では、CEMs が正常に用量と時間依存の方法でだけでなく、急速に可逆的であった方法で GFP レポーターを抑制できたことを示しました (すなわち、24 時間以内)12。蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、および機能を使用して、チップ qPCR6を使用してクロマチン環境を制御する遺伝子の発現を制御する紹介 CEM 技術の能力を特徴とします。ここを使用して、クロマチン生物学に関連する質問に答えるこの制度の適応を容易にする CEMs を特徴付けるのための方法について述べる.
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、用量依存的遺伝子発現と特定の遺伝子のクロマチン環境を規制する適用される最近開発された CEM システムについて述べる。我々 は特定の内因性クロマチン制御調節タンパク質の選択的採用活動によって遺伝子発現の調節に関与するダイナミクスを研究する正確な方法を提供します。これは適用することができます非常にモジュール技術蛋白質-クロマチン修飾の異なる方法を調査…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、役に立つ議論のため・ ハサウェイとジンの研究所のメンバーに感謝したいと思います。著者も原稿の彼らの重要な読書のダン クロナとイアン ・ マクドナルドに感謝します。この作品は一部 (N.A.H.); に米国国立保健研究所から助成金 R01GM118653 によって支えられました。助成金 R01GM122749、R01CA218600 と R01HD088626 米国国立から衛生研究所 (JJ) に。この作品も、層によって支えられた UNC Eshelman イノベーション研究所からの 3 および学生を与える (N.A.H し A.M.C、それぞれ)。(A.M.C) に T-32 GM007092 から追加の資金は、この仕事を支えた。フローサイトメトリーは、UNC 施設に P30 CA016086 がんセンター コア助成金によって資金を供給された UNC 流れ Cytometry 中核施設でデータが得られました。
Materials
| DMEM | Corning | 10-013CV | |
| NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
| BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
| FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
| Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
| Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
| PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
| Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
| Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
| 0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
| 0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
| SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
| H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| (ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
| Sonicator | Covaris | E110 | |
| Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
| SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
| SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
| LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BSA | Fisher | BP9700 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-1 | |
| Tris | Fisher | BP152 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
| Glycine | Fisher | BP381-500 | |
| TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
| HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
| FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
| Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
| DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
| Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
| Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
| Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
| CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
| Lif-1C-alpha – producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |
References
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