Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici
Summary
Regolamento dell’ambiente della cromatina è un processo essenziale necessario per l’espressione genica corretto. Qui, descriviamo un metodo per il controllo dell’espressione genica attraverso il reclutamento di modificante la cromatina macchinari in modo gene-specifico e reversibile.
Abstract
Regolamento di compattazione della cromatina è un importante processo che regola l’espressione genica negli eucarioti superiori. Anche se la compattazione della cromatina e regolazione dell’espressione genica sono interrotti comunemente in molte malattie, un metodo di luogo-specific, endogeno e reversibile per studiare e controllare questi meccanismi d’azione è stata carente. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato e caratterizzato molecole bifunzionali diregolamenti. Un componente della molecola bifunzionale associa a un ancoraggio della DNA-proteina in modo che che saranno assunti per un locus allele-specifico. L’altro componente si impegna endogeno macchinario cellulare modificante la cromatina, reclutamento di queste proteine ad un gene di interesse. Queste piccole molecole, chiamate modificatori epigenetici chimici (CEMs), sono in grado di controllare l’espressione genica e l’ambiente della cromatina in maniera dose-dipendente e reversibile. Qui, dettagliamo un approccio CEM e la sua applicazione per fare diminuire l’espressione genica e l’acetilazione dell’istone coda presso un reporter della proteina fluorescente verde (GFP) situato al luogo del Oct4 in cellule staminali embrionali di topo (mESCs). Ci caratterizzano il piombo CEM (CEM23) utilizzo di microscopia fluorescente, citometria a flusso e immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), seguita da una reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). Mentre il potere di questo sistema è dimostrato a livello del locus Oct4 , concettualmente, la tecnologia CEM è modulare e può essere applicata in altri tipi cellulari e in altri loci genomici.
Introduction
Cromatina è costituito da DNA avvolto intorno alle proteine istoniche istonico che formano la particella nucleosome core. Regolamento di compattazione della cromatina è un meccanismo essenziale per il corretto DNA riparazione, replica e l’espressione1,2,3. Un modo in cui le cellule controllano il livello di compattazione è attraverso l’aggiunta o la rimozione di varie modifiche di coda post-traduzionali degli istoni. Due tali modifiche includono l’acetilazione di lisina (1), che è più comunemente associato con l’attivazione del gene, e (2) lisina metilazione, che può essere associata con l’attivazione del gene o repressione, a seconda del contesto dell’amminoacido. L’aggiunta di segni di acetilazione e metilazione è catalizzata da utilizzando istone acetiltransferasi (Hat) e istone metiltransferasi (HMTs), rispettivamente, mentre la rimozione del marchio avviene istone deacetilasi (HDACs) e istone JmjC (HDMs ), rispettivamente di4,5. Anche se l’esistenza di queste proteine è stato conosciuto per decenni, molti meccanismi di macchinari come modificante la cromatina opere per regolare correttamente l’espressione genica rimangono da definire. Poiché i processi di regolazione della cromatina sono dysregulated in molte malattie umane, nuove comprensioni meccanicistiche potrebbero portare a future applicazioni terapeutiche.
La cromatina in vivo assay (CiA) è una tecnica recentemente descritta che utilizza un induttore chimico di prossimità (CIP) per controllare l’assunzione di macchinari modificante la cromatina a un locus specifico6. Questa tecnologia è stata usata per studiare una lista sempre di dinamica della cromatina, tra cui istone-modificando le proteine, remodelers della cromatina e trascrizione fattori6,7,8,9. CIP-basato della cromatina tethering delle proteine espresse esogenicamente è stato esteso anche passato CiA per modulare loci genetici non modificato da utilizzare con una disattivato cluster regolarmente intervallate breve palindromi ripete CRISPR-collegata della proteina (dCas9) 10 , 11. nel sistema di CiA, mESCs sono stati modificati per esprimere un gene reporter GFP presso il locus Oct4 , una zona altamente espresso e rigorosamente regolamentato del genoma mESC. In precedenza, questo sistema è stato applicato per descrivere il reclutamento dose-dipendente e reversibile della proteina di eterocromatina esogenicamente espresso 1 (HP1), un enzima che lega H3K9me3 e propaga repressivi marchi (ad esempio, H3K9me3) e DNA metilazione6. Per realizzare questo tipo di strategia di reclutamento, la mESCs sono infettati con un plasmide che esprime una proteina di FK506-legante (FKBP) collegata a un Gal4, che è un ancoraggio della DNA-proteina che si lega a una matrice di Gal4-associazione a Monte del reporter GFP. Le cellule inoltre sono infettate con un dominio FKBP-rapamicina-legante (FRB) collegato al HP1. Quando il mESCs sono esposti a concentrazioni nanomolari bassa del CIP, rapamicina, FRB sia FKBP, sono riuniti presso il luogo di destinazione. Nei giorni del trattamento rapamicina, espressione del gene dell’obiettivo è represso, come evidenziato da citometria a flusso e microscopia di fluorescenza e acetilazione dell’istone è diminuita, mostrato da ChIP e del bisolfuro. Mentre lo sviluppo e la convalida di questo approccio sono stati significativi progressi nel campo della ricerca della cromatina e regolamento, uno svantaggio è necessaria espressione esogena di modificante la cromatina macchinari.
Per rendere la tecnologia basata sul reclutamento degli enzimi fisiologicamente rilevanti solo endogeni ed effettuare un sistema più modulare, abbiamo progettato e caratterizzato nuove molecole bifunzionali, definiti CEMs (Figura 1)12. Uno dei componenti del CEMs comprende FK506 che, simile alla rapamicina, lega strettamente e specificamente a FKBP. Così, il CEMs ancora saranno reclutati al locus Oct4 in mESCs La CiA. L’altra componente del CEMs è una molecola che lega endogeno modificante la cromatina macchinari. In uno studio pilota, abbiamo testato CEMs che contengono inibitori HDAC. Mentre il concetto di usare un inibitore di reclutare HDACs sembra contro-intuitivo, l’inibitore è comunque in grado di reclutare attività di HDAC al gene di interesse. Questa operazione viene eseguita (1) reindirizzando le HDAC al locus, rilasciando l’enzima e aumentando la densità di ONU-inibito HDACs nella zona e inibizione di HDAC (2) mantenere a livello del locus, ma complessi repressivi che si legano a HDACs inibito, di reclutamento o (3) una combinazione di entrambi. In uno studio precedente, abbiamo mostrato che il CEMs erano in grado di reprimere con successo il reporter GFP in maniera dose – e tempo-dipendente, così come in un modo che era rapidamente reversibile (cioè, entro 24 ore)12. Abbiamo caratterizzato la capacità della tecnologia CEM presentata qui per controllare l’espressione genica mediante microscopia a fluorescenza, citometria a flusso e la capacità di controllare l’ambiente di cromatina utilizzando ChIP-qPCR6. Qui, descriviamo un metodo per l’utilizzo e che caratterizzano il CEMs, che faciliterà l’adattamento di questo sistema di rispondere a ulteriori domande legate alla biologia della cromatina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo descritto il sistema CEM recentemente sviluppato applicato per regolare l’espressione genica e ambiente di cromatina a un gene specifico in modo dose-dipendente. Forniamo un metodo accurato per studiare le dinamiche coinvolte nella regolazione dell’espressione genica attraverso il reclutamento selettivo di proteine regolatrici della cromatina endogeno specifico. Si tratta di una tecnologia altamente modulare che può essere applicata per studiare come le diverse proteine – e cromatina-modificando complessi f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare i membri dei laboratori Hathaway e Jin per le loro discussioni utili. Gli autori ringraziano anche Dan Crona e Ian MacDonald per loro lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Grant R01GM118653 da US National Institutes of Health (a N.A.H.); e di sovvenzioni R01GM122749, R01CA218600 e R01HD088626 da l’US National istituti di salute (per J.J.). Questo lavoro è stato supportato anche da un tier 3 e uno studente concedere da UNC Eshelman Istituto per l’innovazione (per N.A.H e A.M.C, rispettivamente). Finanziamenti aggiuntivi da un GM007092 di T-32 (al A.M.C) sostenuto questo lavoro. Dati di citometria a flusso è stati ottenuti presso la UNC flusso Cytometry Core Facility finanziata da una sovvenzione di supporto P30 CA016086 Cancer Center Core a UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.
Materials
| DMEM | Corning | 10-013CV | |
| NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
| BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
| FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
| Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
| Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
| PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
| Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
| Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
| 0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
| 0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
| SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
| H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| (ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
| Sonicator | Covaris | E110 | |
| Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
| SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
| SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
| LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BSA | Fisher | BP9700 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-1 | |
| Tris | Fisher | BP152 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
| Glycine | Fisher | BP381-500 | |
| TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
| HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
| FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
| Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
| DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
| Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
| Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
| Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
| CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
| Lif-1C-alpha – producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |
References
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