Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak
Summary
Kromatin çevre düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu için gerekli temel bir işlemdir. Burada, biz gen ekspresyonu kromatin değiştirme alımı yoluyla kontrol etmek için bir yöntem tarif gene özgü ve geri dönüşümlü bir şekilde makine.
Abstract
Düzenleme, kromatin sıkıştırma daha yüksek ökaryotlarda gen ekspresyonu yöneten önemli bir süreçtir. Kromatin sıkıştırma ve gen ifade düzenlemesi yaygın birçok hastalıklarda kesintiye rağmen çalışma ve mekanizmaların eylem kontrol odağı özgü, endojen ve tersinir bir yöntem eksik edilmiştir. Bu sorunu gidermek için biz geliştirdik ve gen düzenleyen yeni bifonksiyonel molekülleri ile karakterizedir. Böylece bir formda özel locus alınacaktır bifonksiyonel molekülünün bir bileşeni bir DNA-protein çapa bağlar. Başka bir bileşen bu proteinler bir gen ilgi için işe endojen hücresel kromatin değiştirme, iş makineleri yürütmektedir. Bu küçük moleküllerin kimyasal epigenetik değiştiriciler (CEMs) denilen, gen ekspresyonu ve kromatin çevre doz bağımlı ve geri dönüşümlü bir şekilde kontrol yeteneğine sahiptirler. Burada, CEM yaklaşım ve gen ekspresyonu ve histon kuyruk asetilasyon Oct4 locus fare embriyonik kök hücreler (mESCs) içinde yer alan yeşil flüoresan Protein (GFP) gazeteci, azaltmak için uygulama ayrıntılı. Biz kurşun karakterize floresan mikroskopisi, akış sitometresi ve kromatin immunoprecipitation (ChIP), CEM (CEM23) takip nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) tarafından. Bu sistemin gücü Oct4 odağı kavramsal olarak gösterilmiştir, CEM teknoloji modüler ve diğer hücre tipleri ve diğer genomik loci uygulanabilir.
Introduction
Kromatin DNA buna sarılarak çekirdek nucleosome parçacık histon octamer proteinleri oluşur. Kromatin sıkıştırma düzenlenmesi için uygun DNA tamir, çoğaltma ve ifade1,2,3temel bir mekanizmadır. Hücreleri sıkıştırma düzeyini kontrol bir ek veya çeşitli post-translational histon kuyruk değişiklikler kaldırılması yoludur. İki tür değişiklikler en çok gen harekete geçirmek ile ilişkilidir, (1) lizin asetilasyon ve gen harekete geçirmek ya da baskı, amino asit bağlama ile ilişkili olabilir (2) lizin metilasyonu içerir. Kaldırma işareti histon uyku (HDACs) ve histon demethylases (HDMs yapılır ise asetilasyon ve metilasyonu işaretleri ilavesi histon acetyltransferases (şapka) ve histon methyltransferases (HMTs), sırasıyla, katalizlenir ), sırasıyla4,5. Bu proteinler varlığını nasıl kromatin değiştirme makine işleri düzgün Gen ifadesinin düzenlenmesi için tanımlanması gereken kalır yıllardır, çeşitli mekanizmalar bilinmektedir rağmen. Kromatin düzenleyici işlemler dysregulated birçok insan hastalıkları içinde olduğundan, yeni mekanik anlayışlar gelecekteki tedavi uygulamaları için neden olabilir.
Kromatin vivo içinde tahlil (CIA) yakınlık (CIP) kimyasal bir uyarıcı kromatin değiştirme makine işe alım denetlemek için belirli locus6kullanan son zamanlarda açıklanan bir tekniktir. Bu teknoloji kromatin dinamikleri histon-modifiye proteinleri, kromatin remodelers ve transkripsiyon faktörleri6,7,8,9dahil olmak üzere, genişleyen bir listesini incelemek için kullanılmaktadır. CIP tabanlı kromatin exogenously ifade proteinlerin hayvan zinciri de CIA sigara değiştiren genetik loci modüle tarafından devre dışı bırakılmış kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa palindromik yinelenen denetim CRISPR ilişkili protein (dCas9) ile kullanmak uzatıldı 10 , 11. CIA sisteminde mESCs GFP muhabir gen Oct4 odağı, son derece ifade ve kesinlikle düzenlenmiş alan mESC genom kopyası, hızlı şekilde değiştirilmiştir. Daha önce bu sistem exogenously ifade heterochromatin protein 1 (HP1), H3K9me3 bağlar ve baskıcı işaretleri (Örneğin, H3K9me3) yayar bir enzim doz bağımlı ve tersinir alımı açıklamak için uygulanan ve DNA metilasyon6. İşe alım stratejisi bu tür yapmak için mESCs bir Gal4 bağlama dizi GFP muhabir için akıntıya karşı bağlar bir DNA-protein çapa bir Gal4 bağlı bir FK506-bağlayıcı protein (FKBP) ifade eder bir plazmid ile bulaşmış. Hücreleri de HP1 için bağlı bir FKBP-rapamycin-bağlayıcı etki (FRB) ile bulaşmış. MESCs CIP konsantrasyonları düşük nanomolar maruz kaldığında, rapamycin, FRB ve FKBP, bir araya getirdi hedef odağı. Gün rapamycin tedavisi içinde ifade hedef Gen tarafından floresans mikroskobu ve akış sitometresi kanıtladığı gibi bastırılmış ve çip ve bisülfit sıralamanın tarafından gösterilen histon asetilasyon azalır. Geliştirme ve doğrulama Bu yaklaşımın kromatin araştırma ve düzenleme alanında önemli gelişmeler olmuştur iken, bir dezavantajı gerekli eksojen kromatin değiştirme ifadesidir makine.
Sadece endojen fizyolojik ilgili enzimler işe üzerinde esaslı teknoloji yapmak ve bir daha modüler sistem yapmak için tasarlanmış ve CEMs (Şekil 1)12olarak adlandırdığı yeni bifonksiyonel molekülleri ile karakterizedir. CEMs bir bileşeni içerir hangi, rapamycin için benzer sıkı ve özellikle bağlar FK506 FKBP için. Böylece, CEMs hala CIA mESCs Oct4 odağı için alınacaktır. Diğer CEMs endojen kromatin değiştirme makine bağlar bir yan bileşenidir. Bir pilot çalışmada, HDAC inhibitörleri içeren CEMs test ettik. HDACs işe almak için bir inhibitörü kullanarak kavramı karşı sezgisel görünüyor olsa da, engelleyici yine de HDAC etkinliği ilgi gen için recruit yapabiliyor. Bu (1) HDAC odağı, enzim, serbest ve alan ve (2) bakımı HDAC inhibisyon odağı, un Inhibe HDACs yoğunluğu artan ama Inhibe HDACs bağlamak baskıcı kompleksleri işe yönlendirme tarafından gerçekleştirilir, veya (3) her ikisinin bir birleşimi. Bir önceki çalışmada, biz CEMs başarıyla GFP muhabir bir doz ve zaman bağımlı şekilde, hem de hızla geri dönüşümlü bir şekilde bastırmak mümkün olduğunu gösterdi (yani, 24 saat içinde)12. Biz burada ChIP-qPCR6kullanarak kromatin ortamını denetlemek için floresans mikroskobu, akış sitometresi ve yetenek kullanarak denetim gen ekspresyonu için sunulan CEM teknoloji yeteneği ile karakterizedir. Burada, biz kullanarak ve kromatin Biyoloji ile ilgili ek sorularınız cevaplamak için bu sistem adaptasyonu kolaylaştıracaktır CEMs karakterize bir yöntem açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, biz gen ekspresyonu ve kromatin çevre belirli bir gen, bir doz bağımlı şekilde düzenleyen uygulanan son zamanlarda geliştirilen CEM sistem nitelendirdi. Biz dinamikleri dahil belirli endojen kromatin düzenleyici proteinler seçici alımı yoluyla Gen ifadesinin düzenlenmesine çalışmak için bir yöntem sağlar. Bu uygulanabilir son derece modüler bir teknolojidir ne kadar farklı protein – ve kromatin-modifiye araştırmak için düzgün dysregulated, bu işlemler ile nasıl gidiyor çalışma olarak…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Hathaway ve Jin laboratuarlar için onların yararlı tartışmalar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar da Dan Crona ve Ian MacDonald el yazması onların eleştirel okuma için teşekkür. Bu eser kısmen Grant R01GM118653 üzerinden ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (için N.A.H.); tarafından desteklenen ve R01CA218600 ve R01HD088626 gelen ABD Ulusal hibe R01GM122749 tarafından Enstitüleri sağlık (JJ için). Bu eser de bir katmanı tarafından desteklenen 3 ve bir öğrenci vermek yenilik için UNC Eshelman Enstitüsünden (N.A.H ve A.M.C, sırasıyla). Ek T-32 GM007092 (A.M.C) finansman bu çalışmaları destekledi. Akış Sitometresi veri UNC akış sitometresi çekirdek bir P30 CA016086 Kanser Merkezi çekirdek destek hibe için UNC Lineberger kapsamlı Kanser Merkezi tarafından finanse edilen tesisinde elde edildi.
Materials
| DMEM | Corning | 10-013CV | |
| NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
| BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
| FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
| Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
| Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
| PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
| Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
| Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
| 0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
| 0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
| SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
| H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| (ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
| Sonicator | Covaris | E110 | |
| Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
| SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
| SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
| LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BSA | Fisher | BP9700 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-1 | |
| Tris | Fisher | BP152 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
| Glycine | Fisher | BP381-500 | |
| TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
| HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
| FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
| Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
| DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
| Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
| Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
| Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
| CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
| Lif-1C-alpha – producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |
References
- Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
- Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Gräff, J., Tsai, L. -. H. Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
- Hathaway, N. A., et al. Dynamics and memory of heterochromatin in living cells. Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).
- Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes. Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).
- Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin. Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).
- Koh, A. S., Miller, E. L., et al. Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance. Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).
- Chen, T., Gao, D., et al. Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System. Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).
- Braun, S. M. G., et al. Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators. Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).
- Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity. ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).
- Kasoji, S. K., et al. Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath. PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).
- Chiarella, A. M., et al. Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications. Biochimie. 57 (19), 2756-2761 (2018).
- Gao, Y., et al. Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators. Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).
