تنقية الخلايا منخفض وفيرة في النظام المرئي المورفولوجية
Summary
نقدم هنا، بروتوكول تفكك خلية لكفاءة عزل الخلايا الحالية في وفرة منخفضة داخل منظومة المورفولوجية البصرية من خلال الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية).
Abstract
وسهلت التحسينات الأخيرة في الحساسية من تسلسل الجيل القادم تطبيق ترانسكريبتوميك والتحاليل الجينية لإعداد صغيرة من الخلايا. استخدام هذه التكنولوجيا لدراسة التنمية في النظام المرئي المورفولوجية، التي تفخر بثروة أدوات الوراثية الخاصة بنوع الخلية، ويوفر نهج قوية لمعالجة الأساس الجزيئي للتنمية مع القرار الخلوية الدقيقة. لهذا نهج أن يكون مجديا، من الأهمية بمكان لديها القدرة على موثوقية وكفاءة تنقية الخلايا الحالية في وفرة منخفضة داخل المخ. نقدم هنا، طريقة تسمح بتنقية فعالة من استنساخ خلية مفردة في التجارب الوراثية الفسيفساء. مع أحكام هذا البروتوكول، نحن دائماً تحقيق عالية غلة خلوية بعد تنقية الأسفار باستخدام تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) (~ 25% من كافة الخلايا المسماة)، وإجراء تحليلات ترانسكريبتوميكس بنجاح في استنساخ خلية واحدة فقط التي تم إنشاؤها من خلال تحليل فسيفساء مع علامة خلية ريبريسيبلي (ماركم). هذا البروتوكول مثالي لتطبيق ترانسكريبتوميك والتحاليل الجينية لأنواع محددة من الخلايا في النظام المرئي، عبر مراحل مختلفة من التنمية، وفي سياق مختلف التلاعبات الجينية.
Introduction
النظام المرئي المورفولوجية نموذج معلقة لدراسة الأساس الجيني للتنمية والسلوك. وتضم بنية خلوية نمطية1 ومجموعة أدوات وراثية متقدمة للتلاعب في خلية معينة أنواع2،3. نقاط قوة رئيسية لهذا النظام هو القدرة على استجواب استقلالية وظيفة الجينات في الخلية أنواع المصالح مع القرار خلية مفردة، باستخدام أساليب فسيفساء الوراثية4،5. وسعينا إلى الجمع بين هذه الأدوات الوراثية مع التقدم الذي أحرز مؤخرا في تسلسل الجيل القادم لتنفيذ ترانسكريبتوميك الخاصة بنوع الخلية واستنساخ تحليل الجينوم في خلية واحدة فقط في التجارب الوراثية الفسيفساء.
ولتحقيق ذلك، من الضروري لتطوير طريقة قوية وفعالة لعزل السكان منخفضة خلية وفيرة في الدماغ بشكل انتقائي. سابقا، قمنا بتطوير بروتوكول لعزل أنواع الخلايا المحددة في النظام المرئي أثناء تطوير الخوادر من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية، وتحديد ترانسكريبتوميس استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي6. في هذه التجارب، كانت الغالبية العظمى من خلايا نوع معين (مثل photoreceptors R7) المسمى فلوريسسينتلي. باستخدام هذا الأسلوب، في التجارب الوراثية الفسيفساء، حيث تتم تسمية مجموعة فرعية فقط من الخلايا من نفس النوع، فشلنا في عزل خلايا كافية للحصول على جودة تسلسل البيانات. ولمعالجة ذلك، سعينا إلى زيادة غلة الخلوية بتحسين البروتوكول تفكك خلية.
وكان نهجنا تقليل الطول الإجمالي للبروتوكول لتحقيق أقصى قدر من صحة الخلايا معزولة، وتحسين الصحة الخلوية بتغيير المخازن المؤقتة للتشريح، وتفكك، وتقليل مقدار اختلال ميكانيكية لتشريح الأنسجة. نحن اختبار بروتوكول تحسين7 باستخدام تحليل فسيفساء مع خلية ريبريسيبلي ماركر5 (ماركم)، الذي يسمح لجيل واحد فلوريسسينتلي المسمى استنساخ أنواع خلية معينة، نوع البرية أو المسخ لجينات للفائدة في إلا يطير متخالف. حيث، في ظروف مماثلة، فشلت لدينا بروتوكول سابق لتوليد ما يكفي من المواد لتسلسل الحمض النووي الريبي، بروتوكول تحسين كان ناجحاً. نحن تكاثر تحقيق عائد خلوية عالية (~ 25% خلايا المسماة)، والحصول على بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي عالية الجودة من 1,000 قدر ضئيل الخلايا7.
وقد وصفت سابقا عددا من البروتوكولات لعزل أنواع خلية معينة في المورفولوجية6،،من89،10،11،،من1213 , 14 , 15 , 16-هذه البروتوكولات معظمها مخصصة لعزل الخلايا التي وفيرة داخل المخ. لدينا بروتوكول هو الأمثل لعزل السكان خلية وفيرة منخفضة (أقل من 100 خلية كل الدماغ) في النظام البصري باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية ترانسكريبتوميك اللاحقة والتحليلات الجينية. مع أحكام هذا البروتوكول، ونحن نهدف إلى توفير وسيلة لعزل تكاثر الخلايا وفرة منخفضة من النظام المرئي يطير بنظام مراقبة الأصول الميدانية، والحصول على بيانات عالية الجودة الترنسكربيتوم بالجيش الملكي النيبالي-ما يليها
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول بسيط وليس من الصعب من الناحية الفنية لتنفيذ، ولكن هناك مفتاح عدة خطوات إذا تجاهل إرادة يسبب انخفاض كبير في الغلة الخلوية. (الخطوة 2.3.2.) من الأهمية بمكان أن الصلبان يتمتعون بصحة جيدة، وأن الطعام لم تجف. سقي العادية من الصلبان ضروري لزيادة عدد الذباب المتاحة لتشريح ذات النمط ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بتمويل هذا البحث من NINDS من “معاهد الصحة الوطنية” تحت رقم جائزة K01NS094545، أندجرانتس من مركز لفلر “دراسة اضطرابات الأعصاب”. نحن نسلم ليمينغ تان وجيسون ماك إيوان لقيمة المحادثات.
Materials
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
