Purificazione di basso-abbondanti cellule nel sistema visivo della drosofila
Summary
Qui, presentiamo un protocollo di dissociazione delle cellule per isolare in modo efficiente le cellule presenti in abbondanza bassa all’interno del sistema visivo di Drosophila attraverso celle attivate la fluorescenza che ordinano (FACS).
Abstract
Recenti miglioramenti nella sensibilità di sequenziamento di nuova generazione hanno facilitato l’applicazione di analisi genomiche e trascrittomica ad un piccolo numero di cellule. Utilizzando questa tecnologia per lo studio di sviluppo nel sistema visivo della drosofila, che vanta una ricchezza di strumenti genetici specifici del tipo di cella, fornisce un approccio potente per affrontare le basi molecolari di sviluppo con precisa risoluzione cellulare. Un siffatto approccio essere fattibile, è fondamentale avere la capacità di attendibilmente ed efficientemente purificare cellule presenti in abbondanza bassa all’interno del cervello. Qui, presentiamo un metodo che permette di purificazione efficiente di singola cellula Clona in esperimenti di mosaico genetico. Con questo protocollo, realizziamo costantemente un alto rendimento cellulare dopo purificazione mediante fluorescenza attivato cella ordinamento (FACS) (~ 25% di tutte le celle con etichettate) ed eseguito con successo analisi trascrittomica su singola cellula cloni generati attraverso analisi di mosaico con un indicatore di cella reprensibile (MARCM). Questo protocollo è ideale per l’applicazione di analisi genomiche e trascrittomica di tipi cellulari specifici nel sistema visivo, attraverso diverse fasi di sviluppo e nel contesto delle diverse manipolazioni genetiche.
Introduction
Il sistema visivo di Drosophila è un eccezionale modello per studiare la base genetica dello sviluppo e comportamento. Si compone di un’ architettura cellulare stereotipato1 e un toolkit di genetico avanzato per la manipolazione delle cellule specifiche tipi2,3. Un punto di forza di questo sistema è la capacità di interrogare in modo autonomo la funzione del gene in tipi cellulari di interesse con risoluzione singola cella, utilizzando metodi mosaico genetico4,5. Abbiamo cercato di combinare questi strumenti genetici con gli avanzamenti recenti nel sequenziamento di nuova generazione per eseguire cella specifica del tipo trascrittomica e analisi genomica nella singola cella cloni in esperimenti di mosaico genetico.
A tale scopo, è essenziale sviluppare una tecnica robusta ed efficiente per isolare selettivamente popolazioni bassa abbondante delle cellule nel cervello. In precedenza, abbiamo sviluppato un protocollo per isolare tipi cellulari specifici nel sistema visivo durante lo sviluppo Pupa mediante FACS e determinare la loro trascrittomi utilizzando RNA-seq6. In questi esperimenti, la stragrande maggioranza delle cellule di un tipo particolare (ad es. R7 fotorecettori) fluorescente sono stata etichettata. Utilizzando questo metodo, negli esperimenti di mosaico genetico, in cui sono etichettati solo un sottoinsieme delle cellule dello stesso tipo, non siamo riusciti a isolare abbastanza cellule per ottenere dati di sequenziamento di qualità. Per risolvere questo problema, abbiamo cercato di aumentare il rendimento cellulare migliorando il protocollo di dissociazione delle cellule.
Il nostro approccio era quello di diminuire la lunghezza totale del protocollo per massimizzare la salute delle cellule dissociate, migliorare la salute cellulare alterando la dissezione e la dissociazione di buffer e ridurre la quantità di rottura meccanica al tessuto dissecato. Abbiamo testato il protocollo migliore7 usando analisi di mosaico con una cella reprensibile indicatore5 (MARCM), che permette la generazione di singolo fluorescente etichettati cloni particolari tipi di cellule, che sono wild-type o mutanti per un gene di interesse in un in caso contrario eterozigote fly. Dove, in condizioni identiche, il nostro protocollo precedente non è riuscito a generare abbastanza materiale per RNA-seq, il protocollo migliore era successo. Abbiamo riproducibile raggiungere un alto rendimento cellulare (~ 25% delle cellule con etichettate) e ottenere alta qualità RNA-seq dati da appena 1.000 cellule7.
Un numero di protocolli precedentemente è stati descritti per isolare particolare cellula scrive dentro drosofila6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. questi protocolli sono progettati principalmente per isolare le cellule che sono abbondanti all’interno del cervello. Il nostro protocollo è ottimizzato per isolare popolazioni di cellule abbondanti basso (meno di 100 cellule per cervello) nel sistema visivo utilizzando FACS per analisi genomiche e trascrittomica successiva. Con questo protocollo, ci proponiamo di fornire un modo per isolare riproducibile basse abbondanti cellule dal sistema visivo Vola FACS e ottenendo dati del trascrittoma di alta qualità di RNA-seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è semplice e non tecnicamente difficili da eseguire, ma ci sono chiave diversi passaggi che se trascurato volontà causare una notevole riduzione di resa cellulare. (Passaggio 2.3.2). È fondamentale che le croci sono sani, e che il cibo non si asciughi. Annaffiature regolari di croci è essenziale per massimizzare il numero di mosche disponibili per dissezione del genotipo giusto e nella corretta fase di sviluppo. Quanto spesso croci c’è bisogno di essere innaffiato variano a seconda il cibo utilizza…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dal NINDS dei National Institutes of Health, sotto numero premio K01NS094545, andgrants dal centro Lefler per la studio di Malattie Neurodegenerative. Riconosciamo Liming Tan e Jason McEwan per conversazioni importanti.
Materials
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
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