Purificación de células poco abundantes en el sistema Visual de Drosophila
Summary
Aquí, presentamos un protocolo de disociación celular para aislar eficazmente las células presentes en baja abundancia dentro del sistema visual de Drosophila mediante célula de fluorescencia activada (FACS) de clasificación.
Abstract
Recientes mejoras en la sensibilidad de la secuencia de la generación siguiente han facilitado la aplicación de análisis genómicos y transcriptómicos a una pequeña cantidad de células. Utilizando esta tecnología para estudiar el desarrollo en el sistema visual de Drosophila, que cuenta con una amplia variedad de herramientas genéticas de tipo específico de célula, ofrece un poderoso enfoque para abordar la base molecular del desarrollo con resolución celular precisa. Para que este enfoque ser factible, es crucial tener la capacidad para confiablemente y eficientemente purificar células presentes en baja abundancia en el cerebro. Aquí, presentamos un método que permite la purificación eficiente de clones celulares solo en experimentos de genética mosaico. Con este protocolo, consistentemente lograr un alto rendimiento celular después de purificación usando fluorescencia activada (FACS) (~ 25% de todas las células etiquetadas) de clasificación de la célula y realizado con éxito análisis de transcriptómica en clones de células individuales generados a través de Análisis de mosaico con un marcador de célula repressible (MARCM). Este protocolo es ideal para aplicar análisis genómicos y transcriptómicos a tipos celulares específicos en el sistema visual, a través de diferentes etapas de desarrollo y en el contexto de diferentes manipulaciones genéticas.
Introduction
El sistema visual de Drosophila es un excelente modelo para estudiar la base genética del desarrollo y del comportamiento. Se compone de una arquitectura celular estereotipados1 y un kit de herramientas genética avanzada para la manipulación específica de la célula tipo2,3. Una fuerza importante de este sistema es la capacidad de interrogar autónomamente funciones de los genes en los tipos de células de interés con una resolución de única célula, utilizando mosaico genético métodos4,5. Se intentó combinar estas herramientas genéticas con los avances recientes en la siguiente secuencia de generación para realizar transcriptómicos de tipo-específicas de la célula y análisis genómicos en célula única clones en experimentos de genética mosaico.
Para lograr esto, es esencial para desarrollar un método robusto y eficiente para aislar selectivamente poblaciones baja celular abundante en el cerebro. Previamente, hemos desarrollado un protocolo para aislamiento de tipos celulares específicos en el sistema visual durante el desarrollo pupal por FACS y determinar su transcriptomas usando RNA-seq6. En estos experimentos, la mayoría de las células de un tipo particular (p. ej. fotorreceptores de R7) fluorescencia fueron etiquetada. Usando este método, en experimentos de genética mosaico, en donde sólo un subconjunto de células del mismo tipo están marcados, no pudimos aislar suficientes células para obtener datos de calidad de la secuencia. Para abordar esto, intentamos aumentar el rendimiento celular mejorando el protocolo de disociación celular.
Nuestro enfoque fue disminuir la longitud total del protocolo para maximizar la salud de las células disociadas, mejorar la salud celular alterando búferes de disección y disociación y reducir la cantidad de interrupción mecánica para el tejido disecado. Probamos el protocolo mejorado7 usando análisis de mosaico con una célula repressible marcador5 (MARCM), que permite la generación de solo fluorescencia etiquetada clones particulares tipos de células, tipo salvaje y mutante para un gen de interés en un de lo contrario heterozigótico mosca. Donde, en condiciones idénticas, nuestro protocolo anterior ha podido generar suficiente material para RNA-seq, el protocolo de mejora era acertado. Reproducible, lograr un alto rendimiento celular (~ 25% de células marcadas) y obtener datos de RNA-seq de alta calidad de tan sólo 1.000 células7.
Un número de protocolos se ha descrito previamente para aislar a tipos de concreto celular en Drosophila6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. estos protocolos sirven sobre todo para aislar las células que son abundantes en el cerebro. Nuestro protocolo está optimizado para aislar poblaciones de células abundantes bajas (menos de 100 células por cerebro) en el sistema visual utilizando FACS para análisis genómicos y transcriptómicos posterior. Con este protocolo, nuestro objetivo es proporcionar una manera de aislar reproducible bajo abundantes células del sistema visual mosca FACS y obteniendo datos de alta calidad transcriptoma por RNA-seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo es simple y no es técnicamente difícil ejecutar, pero hay claves varios pasos que si se pasa por alto la voluntad de provocar una reducción considerable en el rendimiento celular. (Paso 2.3.2.) Es crucial que los cruces son saludables, y que los alimentos no se resequen. Riego regular de cruces es esencial para maximizar el número de moscas disponibles para la disección del genotipo adecuado y en la etapa correcta de desarrollo. Con qué frecuencia necesidad de cruces a regar variará dependiendo de l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por el NINDS de los institutos nacionales de salud con el número de concesión K01NS094545, andgrants del centro para el estudio de enfermedades neurodegenerativas Lefler. Reconocemos Tan encalado y Jason McEwan para conversaciones valiosas.
Materials
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
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