ショウジョウバエ視覚系における低豊富な細胞の浄化
Summary
ここでは、効率的に細胞蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えをショウジョウバエ視覚系内低豊富で存在を隔離するための細胞解離プロトコルを提案する.
Abstract
次世代シークエンシングの感受性の最近の改善はトランスクリプトームとゲノム解析の少数のセルへの適用を容易にしました。携帯型固有の遺伝的ツールの富を誇るショウジョウバエ視覚系における開発にこの技術を活用した正確な携帯電話の解像度を持つ開発の分子基盤に対処するための強力なアプローチを提供します。このようなアプローチ可能であること、確実かつ効率的に細胞脳内低豊富で存在を浄化する能力を持っていることが重要です。遺伝のモザイク実験単一細胞のクローンの効率的な精製ができる方法を紹介します。このプロトコルで一貫して実現高収率の細胞蛍光を用いた浄化セル (FACS) (ラベルのすべてのセルの ~ 25%) を並べ替えをアクティブ化してによって生成された単一のセル複製のトランスクリプトーム解析を正常に実行モザイク解析抑制型細胞のマーカー (MARCM)。このプロトコルは、特定の細胞型へのトランスクリプトームとゲノム解析を開発と異なる遺伝的操作のコンテキストでのさまざまな段階で視覚システムの適用に最適です。
Introduction
ショウジョウバエ視覚系は、発達や行動の遺伝的基盤を研究するための優れたモデルです。ステレオタイプ化された細胞アーキテクチャ1と特定のセル型2,3を操作するための高度な遺伝子のツールキットを装備されています。このシステムの主要な強さは、自律的遺伝的モザイク メソッド4,5を使用して、単一のセル解像度に目的のセル型で遺伝子の機能を調べる機能です。我々 はこれらの遺伝学的ツールを組み合わせてセル型固有トランスクリプトームを実行する次世代シーケンシングの最近の進歩しようし、単一細胞でゲノム解析の遺伝的モザイク実験でクローンを作成します。
これを行うには、脳内低豊富な細胞集団を選択的に分離する堅牢で効率的な手法の開発が不可欠です。以前は、FACS、によって蛹の発育中に視覚系における特定の細胞型を分離し、RNA シーケンス6を使用して彼らのトランスクリプトームを決定するためのプロトコルを開発しました。これらの実験で (例えばR7 視細胞) 特定のタイプの細胞の大半は蛍光標識しました。前記同じ種類の細胞のサブセットだけがラベル付けされて、遺伝のモザイクの実験でこのメソッドを使用して我々 は品質シーケンス データを取得するのに十分な細胞を分離できませんでした。これに対処するため、我々 は細胞解離プロトコルを改善することによって細胞の収穫を増加する求めた。
我々 のアプローチは、解離細胞の健康を最大限、解離と解離のバッファーを変更することにより細胞の健康を改善するためのプロトコルの合計の長さを減少させ、切り裂かれたティッシュの機械停止の量を減らすことだった。我々 はモザイク解析を用いた抑制型セル マーカー5 (MARCM)、野生型かの興味の遺伝子の突然変異体をある特定のセル型のクローンを蛍光標識する単一の生成を可能にする改善された議定書7をテストします。それ以外の場合をヘテロ飛ぶ。ここで、同一条件の下で私たちの以前のプロトコルは RNA シーケンスの十分な材料を生成する失敗、改良されたプロトコルに成功しました。私たちは再現性をもって高細胞収率 (標識細胞の ~ 25%) を達成するため、1,000 ほどの細胞7から高品質 RNA シーケンス データを得ます。
いくつかのプロトコルはショウジョウバエ6,8,9,10、11,12,13種類の特定のセルを隔離する以前記載されています。,14,15,16します。 これらのプロトコルは脳の中で豊富な細胞を分離、大抵。我々 のプロトコルは、その後トランスクリプトームとゲノム解析の FACS を用いた視覚システムで低豊富な細胞集団 (脳あたりより少ない 100 細胞) を分離することに最適です。このプロトコルでは、再現性をもって FACS と RNA シーケンスによる高品質トランスクリプトーム データの取得によってフライ視覚系から低豊富な細胞を分離する方法を提供を目指してください。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルはシンプルで、実行する技術的に困難ではないが、いくつかの重要なステップの意志を見落としている場合があります携帯電話の収量がかなり低下します。(ステップ 2.3.2。)十字架は、健康と食べ物が乾かないことが重要です。十字の定期的な散水は、ハエは、開発の適切な段階では、右の遺伝子型の郭清可能数を最大化するために不可欠です。どのくらいの頻度をまかれる?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、賞を受賞番号 K01NS094545、神経変性疾患研究センター ・ レフラーから切り替えたの下健康の国民の協会の NINDS によって賄われていた。我々 は、貴重な会話のため石灰タンとジェイソン マキューアンを認めます。
Materials
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
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