כאן, אנו מציגים פרוטוקול דיסוציאציה תא לבידוד ביעילות תאים נוכח שפע נמוך בתוך מערכת הראייה דרוזופילה דרך התא פלורסצנטיות מופעל מיון (FACS).
השיפורים האחרונים בהרגישות של רצף הדור הבא יש הקלה היישום של transcriptomic וניתוחים גנומית למספר קטן של תאים. ניצול הטכנולוגיה הזאת ללמוד פיתוח במערכת דרוזופילה חזותי, ובו שפע של כלים גנטיים ייחודיים לסוג התא, מספקת גישה רב-עוצמה למיעון הבסיס המולקולרי של פיתוח עם רזולוציה הסלולר מדויק. עבור גישה כזו להיות ריאלי, זה הכרחי יש את היכולת לשלוט בצורה אמינה ויעילה לטהר תאים נוכח שפע נמוך בתוך המוח. כאן, אנו מציגים שיטה המאפשרת טיהור יעיל של תא בודד שיבוטים בניסויים פסיפס גנטי. עם פרוטוקול זה, נוכל להגיע באופן עקבי הסלולר תשואה גבוהה לאחר טיהור באמצעות קרינה פלואורסצנטית מופעל התא מיון (FACS) (% ~ 25 תאים עם תוויות כל), בהצלחה ביצע ניתוחים transcriptomics על שיבוטים תא בודד שנוצר דרך ניתוח פסיפס עם סמן תא repressible (MARCM). פרוטוקול זה הינו אידיאלי עבור החלת transcriptomic וניתוחים גנומית לסוגי תאים מסוים ב מערכת הראייה, מעבר בשלבים שונים של פיתוח, בהקשר של שינויים גנטיים שונים.
מערכת הראייה דרוזופילה הוא מודל מצטיינים ללמוד את הבסיס הגנטי של התפתחות והתנהגות. זה מורכב של אדריכלות הסלולר הסטראוטיפי1 ערכת כלים גנטיים מתקדמים מניפולציות תא ספציפי סוגים2,3. כוח מרכזי של מערכת זו היא היכולת לחקור באופן עצמאי את ג’ין פונקציה סוגי תאים עניין עם רזולוציה תא בודד, באמצעות פסיפס גנטי שיטות4,5. חיפשנו לשלב כלים גנטיים אלה עם התפתחויות אחרונות רצף הדור הבא כדי לבצע transcriptomic ייחודיים לסוג התא, ניתוח גנומי בתא יחיד שיבוטים בניסויים פסיפס גנטי.
כדי לעשות זאת, זה חיוני לפתח שיטה חזקה ויעילה לבודד באופן סלקטיבי תא בשפע נמוך אוכלוסיות במוח. בעבר, פיתחנו פרוטוקול עבור בידוד סוגי תאים ספציפיים ב מערכת הראייה במהלך הפיתוח הגולמי דרך FACS, וקביעת transcriptomes שלהם באמצעות ה-RNA-seq6. בניסויים אלה, הרוב המכריע של תאים מסוג מסוים (למשל photoreceptors R7) הודבקו תוויות fluorescently. באמצעות שיטה זו, בניסויים פסיפס גנטי, שבה מסומנים רק ערכת משנה של תאים מאותו סוג, נכשלנו לבודד מספיק תאים כדי להשיג איכות רצף הנתונים. כדי לטפל בבעיה זו, חיפשנו להגברת התאית על ידי שיפור בפרוטוקול דיסוציאציה התא.
הגישה שלנו היתה להקטין את האורך הכולל של פרוטוקול כדי למקסם את הבריאות של תאים הפומבית, לשפר את הבריאות התאית על ידי שינוי מאגרי לנתיחה, דיסוציאציה, להפחית את כמות הפרעה מכנית הרקמה גזור. . בדקנו את פרוטוקול משופרת7 באמצעות ניתוח פסיפס עם תא repressible סמן5 (MARCM), אשר מאפשר לדור של בודדת fluorescently המסומנות שיבוטים של סוגי לתא מסוים, פראי סוג או מוטציה עבור הגן עניין ב אחרת משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים לטוס. שם, בתנאים זהים, פרוטוקול קודמות שלנו נכשל לייצר מספיק חומר RNA-seq, פרוטוקול משופרת היה מוצלח. אנו reproducibly להשיג תשואה גבוהה הסלולר (% ~ 25 תאים עם תוויות), להשיג נתונים RNA-seq באיכות גבוהה של תאים קטנה כמו 1,0007.
מספר פרוטוקולים שתוארו קודם לכן כדי לבודד סוגי לתא מסוים דרוזופילה6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. פרוטוקולים אלה נועדו בעיקר עבור בידוד תאים שנמצאים בשפע בתוך המוח. פרוטוקול שלנו ממוטבת עבור בידוד אוכלוסיות תאים בשפע נמוך (פחות מ- 100 תאי המוח) ב מערכת הראייה באמצעות FACS עבור transcriptomic הבאים וניתוחים גנומית. עם פרוטוקול זה, אנו שואפים לספק דרך reproducibly בידוד תאי שופע נמוכה של מערכת הראייה לעוף על ידי FACS וקבלת נתונים transcriptome באיכות גבוהה על ידי RNA-תת סעיף.
פרוטוקול זה הוא פשוט לא טכנית קשה לביצוע, אבל יש מפתח מספר צעדים זה אם מתעלמים מהם רצון לגרום לירידה ניכרת התשואה הסלולר. (שלב 2.3.2.) זה הכרחי כי צלבים הם בריאים, כי האוכל לא יתייבש. השקיה של צלבים חיוני כדי למקסם את מספר זבובים זמין עבור ניתוח של גנוטיפ נכון את, בשלב הנכון של פיתוח. באיזו תדירות…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן על ידי NINDS של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספר פרס K01NS094545, andgrants מן המרכז לפלר עבור המחקר של הפרעות ניווניות. אנו להכיר לימינג טאן ו ג’ייסון מקיואן לשיחות יקרי ערך.
Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
Papain | Worthington | LK003178 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |