טיהור של התאים נמוך-שפע ב מערכת הראייה דרוזופילה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול דיסוציאציה תא לבידוד ביעילות תאים נוכח שפע נמוך בתוך מערכת הראייה דרוזופילה דרך התא פלורסצנטיות מופעל מיון (FACS).
Abstract
השיפורים האחרונים בהרגישות של רצף הדור הבא יש הקלה היישום של transcriptomic וניתוחים גנומית למספר קטן של תאים. ניצול הטכנולוגיה הזאת ללמוד פיתוח במערכת דרוזופילה חזותי, ובו שפע של כלים גנטיים ייחודיים לסוג התא, מספקת גישה רב-עוצמה למיעון הבסיס המולקולרי של פיתוח עם רזולוציה הסלולר מדויק. עבור גישה כזו להיות ריאלי, זה הכרחי יש את היכולת לשלוט בצורה אמינה ויעילה לטהר תאים נוכח שפע נמוך בתוך המוח. כאן, אנו מציגים שיטה המאפשרת טיהור יעיל של תא בודד שיבוטים בניסויים פסיפס גנטי. עם פרוטוקול זה, נוכל להגיע באופן עקבי הסלולר תשואה גבוהה לאחר טיהור באמצעות קרינה פלואורסצנטית מופעל התא מיון (FACS) (% ~ 25 תאים עם תוויות כל), בהצלחה ביצע ניתוחים transcriptomics על שיבוטים תא בודד שנוצר דרך ניתוח פסיפס עם סמן תא repressible (MARCM). פרוטוקול זה הינו אידיאלי עבור החלת transcriptomic וניתוחים גנומית לסוגי תאים מסוים ב מערכת הראייה, מעבר בשלבים שונים של פיתוח, בהקשר של שינויים גנטיים שונים.
Introduction
מערכת הראייה דרוזופילה הוא מודל מצטיינים ללמוד את הבסיס הגנטי של התפתחות והתנהגות. זה מורכב של אדריכלות הסלולר הסטראוטיפי1 ערכת כלים גנטיים מתקדמים מניפולציות תא ספציפי סוגים2,3. כוח מרכזי של מערכת זו היא היכולת לחקור באופן עצמאי את ג’ין פונקציה סוגי תאים עניין עם רזולוציה תא בודד, באמצעות פסיפס גנטי שיטות4,5. חיפשנו לשלב כלים גנטיים אלה עם התפתחויות אחרונות רצף הדור הבא כדי לבצע transcriptomic ייחודיים לסוג התא, ניתוח גנומי בתא יחיד שיבוטים בניסויים פסיפס גנטי.
כדי לעשות זאת, זה חיוני לפתח שיטה חזקה ויעילה לבודד באופן סלקטיבי תא בשפע נמוך אוכלוסיות במוח. בעבר, פיתחנו פרוטוקול עבור בידוד סוגי תאים ספציפיים ב מערכת הראייה במהלך הפיתוח הגולמי דרך FACS, וקביעת transcriptomes שלהם באמצעות ה-RNA-seq6. בניסויים אלה, הרוב המכריע של תאים מסוג מסוים (למשל photoreceptors R7) הודבקו תוויות fluorescently. באמצעות שיטה זו, בניסויים פסיפס גנטי, שבה מסומנים רק ערכת משנה של תאים מאותו סוג, נכשלנו לבודד מספיק תאים כדי להשיג איכות רצף הנתונים. כדי לטפל בבעיה זו, חיפשנו להגברת התאית על ידי שיפור בפרוטוקול דיסוציאציה התא.
הגישה שלנו היתה להקטין את האורך הכולל של פרוטוקול כדי למקסם את הבריאות של תאים הפומבית, לשפר את הבריאות התאית על ידי שינוי מאגרי לנתיחה, דיסוציאציה, להפחית את כמות הפרעה מכנית הרקמה גזור. . בדקנו את פרוטוקול משופרת7 באמצעות ניתוח פסיפס עם תא repressible סמן5 (MARCM), אשר מאפשר לדור של בודדת fluorescently המסומנות שיבוטים של סוגי לתא מסוים, פראי סוג או מוטציה עבור הגן עניין ב אחרת משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים לטוס. שם, בתנאים זהים, פרוטוקול קודמות שלנו נכשל לייצר מספיק חומר RNA-seq, פרוטוקול משופרת היה מוצלח. אנו reproducibly להשיג תשואה גבוהה הסלולר (% ~ 25 תאים עם תוויות), להשיג נתונים RNA-seq באיכות גבוהה של תאים קטנה כמו 1,0007.
מספר פרוטוקולים שתוארו קודם לכן כדי לבודד סוגי לתא מסוים דרוזופילה6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. פרוטוקולים אלה נועדו בעיקר עבור בידוד תאים שנמצאים בשפע בתוך המוח. פרוטוקול שלנו ממוטבת עבור בידוד אוכלוסיות תאים בשפע נמוך (פחות מ- 100 תאי המוח) ב מערכת הראייה באמצעות FACS עבור transcriptomic הבאים וניתוחים גנומית. עם פרוטוקול זה, אנו שואפים לספק דרך reproducibly בידוד תאי שופע נמוכה של מערכת הראייה לעוף על ידי FACS וקבלת נתונים transcriptome באיכות גבוהה על ידי RNA-תת סעיף.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה הוא פשוט לא טכנית קשה לביצוע, אבל יש מפתח מספר צעדים זה אם מתעלמים מהם רצון לגרום לירידה ניכרת התשואה הסלולר. (שלב 2.3.2.) זה הכרחי כי צלבים הם בריאים, כי האוכל לא יתייבש. השקיה של צלבים חיוני כדי למקסם את מספר זבובים זמין עבור ניתוח של גנוטיפ נכון את, בשלב הנכון של פיתוח. באיזו תדירות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי NINDS של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספר פרס K01NS094545, andgrants מן המרכז לפלר עבור המחקר של הפרעות ניווניות. אנו להכיר לימינג טאן ו ג’ייסון מקיואן לשיחות יקרי ערך.
Materials
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
