Rening av låg-riklig celler i Drosophila visuella systemet
Summary
Här presenterar vi ett cell dissociation protokoll för effektivt isolera celler närvarande vid låg överflöd inom Drosophila visuella systemet genom fluorescens aktiverad cell sortering (FACS).
Abstract
Senaste förbättringar av känsligheten av nästa generations sekvensering har underlättat tillämpningen av transcriptomic och genomiska analyser på litet antal celler. Utnyttja denna teknik för att studera utvecklingen i Drosophila visuella systemet, som ståtar med en mängd cell typspecifika genetiska verktyg, ger en kraftfull metod för att hantera den molekylära basen för utveckling med precisa cellulära upplösning. För en sådan vara genomförbart, är det viktigt att ha kapacitet att tillförlitligt och effektivt rena celler närvarande vid låg överflöd i hjärnan. Här presenterar vi en metod som möjliggör effektiv rening av enstaka cell kloner i genetiska mosaik experiment. Med detta protokoll uppnå vi konsekvent en hög cellulära avkastning efter rening med hjälp av fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) (~ 25% av alla märkta celler), och framgångsrikt utfört transkriptomik analyser på enstaka cell kloner genereras genom Mosaic analys med en repressible cell markör (MARCM). Detta protokoll är idealisk för att applicera transcriptomic och genomiska analyser till specifika celltyper i det visuella systemet, över olika stadier av utveckling och inom ramen för olika genetiska manipulationer.
Introduction
Drosophila visuella systemet är en enastående modell för att studera den genetiska grunden för utveckling och beteende. Den består av en stereotyp cellulära arkitektur1 och en avancerad genetisk toolkit för att manipulera specifika cell typer2,3. En stor styrka med detta system är förmågan att självständigt förhöra geners funktion i celltyper sevärdheter med enstaka cell upplösning, använder genetiska mosaik metoder4,5. Vi försökt kombinera dessa genetiska verktyg med senaste framstegen inom nästa generations sekvensering att utföra cell typspecifika transcriptomic och genomiska analyser i enskild cell kloner i genetiska mosaik experiment.
För att åstadkomma detta, är det nödvändigt att utveckla en robust och effektiv metod för att isolera selektivt låga riklig cellpopulationer i hjärnan. Tidigare har utvecklat vi ett protokoll för att isolera specifika celltyper i det visuella systemet under Pupp utveckling genom FACS, och avgöra deras transcriptomes som använder RNA-seq6. I dessa experiment, var den stora majoriteten av celler av en viss typ (t.ex. R7 fotoreceptorer) fluorescently märkt. Med den här metoden i genetiska mosaik experiment, där endast en delmängd av celler av samma typ är märkta, misslyckats vi med att isolera tillräckligt med celler för att få kvalitet sekvensering data. För att lösa detta, försökte vi öka cellulär avkastningen genom att förbättra cell dissociation protokollet.
Vår strategi var att minska den totala längden av protokollet att maximera hälsa dissocierade celler, förbättra cellulär hälsa genom att ändra dissektion och dissociation buffertar, och minska den mekaniska störningar i dissekerade vävnad. Vi testade den förbättra protokoll7 med hjälp av mosaic analys med en repressible cell markör5 (MARCM), som tillåter generation av enkel fluorescently märkt kloner av speciella celltyper, som vildtyp eller mutant för en gen av intresse i en annars heterozygot fluga. Där, under identiska förhållanden, vår tidigare protokoll misslyckades med att generera tillräckligt med material för RNA-seq, var förbättrad protokollet framgångsrik. Vi reproducibly uppnå en cellernas kickavkastning (~ 25% av märkt celler) och få hög kvalitet RNA-seq data från så lite som 1000 celler7.
Ett antal protokoll har beskrivits tidigare för att isolera särskilda celltyper i Drosophila6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. dessa protokoll är främst avsedda för att isolera cellerna som finns i överflöd i hjärnan. Våra protokoll är optimerad för att isolera låg rikligt cellpopulationer (färre än 100 celler per hjärnan) i det visuella systemet med FACS för efterföljande transcriptomic och genomiska analyser. Med detta protokoll, vi strävar efter att ge ett sätt att isolera reproducibly låg rikligt celler från FACS och erhålla högkvalitativ transkriptom data av RNA-följande punkter flyga visuella systemet
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll är enkel och inte tekniskt svår att utföra, men det finns flera viktiga steg som om förbises kommer att orsaka en betydande minskning av cellulära avkastning. (Steg 2.3.2.) Det är avgörande att korsar är friska och att maten inte torkar ut. Regelbunden vattning av korsar är viktigt att maximera antalet flugor tillgängliga för dissektion som är av rätt genotyp och i rätt skede av utveckling. Hur ofta korsar behöver vattnas varierar beroende på den mat som används och inhysa villkorar av fl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen finansierades av NINDS av det nationella Institutes of Health award nummer K01NS094545, andgrants från Lefler Center för den studie av neurodegenerativa sjukdomar. Vi erkänner kalkning Tan och Jason McEwan för värdefulla samtal.
Materials
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
