Gelijktijdige elektrische en mechanische stimulatie ter verbetering van de cellen Cardiomyogenic potentieel

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de opleiding van de bevolking van een cel met behulp van elektrische en mechanische stimuli emuleren cardiale fysiologie. Deze elektromechanische stimulatie verbetert het cardiomyogenic potentieel van de behandelde cellen en is een veelbelovende strategie voor verdere celtherapie, ziekte modellering en drug screening.

Abstract

Cardiovasculaire aandoeningen zijn de belangrijkste doodsoorzaak in de ontwikkelde landen. Bijgevolg heeft de vraag naar effectieve cardiale celtherapieën gemotiveerd onderzoekers in de cel van de stam en bioengineering velden te ontwikkelen in vitro HiFi-menselijke myocard voor zowel basisonderzoek en klinische toepassingen. De onrijpe fenotype van hartcellen is echter een beperking op het verkrijgen van weefsels die functioneel na te bootsen de volwassen myocard, dat vooral wordt gekenmerkt door mechanische en elektrische signalen. Het doel van dit protocol is dus, voor te bereiden en oudere van de cel doelgroep door middel van elektromechanische stimulatie, Recapitulerend fysiologische parameters. Cardiale weefselengineering evolueert naar meer biologische benaderingen en strategieën op basis van biofysische stimuli, dus, zijn goed op stoom. Het apparaat ontwikkeld voor dit doel is uniek en kan afzonderlijk of gelijktijdig elektrische en mechanische stimulatie, zorgvuldig gekenmerkt en gevalideerd. Bovendien, hoewel de methode is geoptimaliseerd voor deze stimulator en de bevolking van een specifiek cel, kan het gemakkelijk worden aangepast aan andere apparaten en cellijnen. De resultaten hier bieden bewijs van de toegenomen cardiale verbintenis de celpopulatie na elektromechanische stimulatie. Electromechanically gestimuleerd cellen tonen een verhoogde expressie van belangrijkste cardiale markers, met inbegrip van vroege, structurele en calcium-regulering genen. Deze cel conditionering kan nuttig zijn voor verdere regeneratieve celtherapie, ziekte modelleren, en high-throughput drug screening.

Introduction

Hartfunctie is gebaseerd op de koppeling van elektrische excitatie en contractie van de mechanische. Kort, cardiomyocyte intercellulaire kruispunten toestaan elektrische signaal doorgeven aan het produceren van bijna synchrone contracties van het hart dat bloed pomp, systemisch en via het pulmonaire systeem. Hartcellen, ondergaan dus zowel elektrische en mechanische krachten die regelen van gen expressie en cellulaire functie. Dienovereenkomstig, vele groepen hebben geprobeerd te ontwikkelen cultuur platformen die de cardiale fysiologische omgeving om te begrijpen van de rol van mechanische en elektrische stimulatie op cardiale ontwikkeling, functie en rijping na te bootsen. In vitro elektrische en mechanische stimulaties individueel toegepaste uitgebreid in cardiale weefselengineering functionele eigenschappen verbeteren, cel rijping vergroten of verbeteren cel koppeling en calcium behandeling^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21}. synchrone elektromechanische conditionering blijft echter onbenut vanwege de uitdaging van de ontwikkeling van een stimulator en protocol, en de verplichte optimalisatie²².

Voorbereidende werkzaamheden gericht elektromechanische stimulatie als een combinatie van elektrische stimulatie en media perfusie; de stroom gaat echter niet om de stam gebaseerde vervorming typische van ventriculaire vulling^23,24,25. Later meer fysiologische benaderingen elektrische prikkels gecombineerd met fysieke vervorming of uitrekken om na te bootsen de isovolumetric contractie^{26,27,28,29,30 ,31}. Feng et al. beschreef de eerste demonstratie van elektromechanische stimulatie in 2005, rapportage cardiomyocyte grootte en contractiele eigenschappen²⁶verbeterd. Wang et al. mesenchymale stamcellen met 5-azacytidine voorbehandeld en gelijktijdige elektrische en mechanische conditionering, verbetering van de recellularization, levensvatbaarheid van de cellen, cardiale differentiatie en weefsel remodeling²⁷toegepast. Sinds die publicaties, meer groepen hebben gemeld op elektromechanische stimulatie van cel monolayers of weefsels (bijvoorbeeld zwart²⁸Vunjak-Novakovic^29,31, en onze fractie³⁰) ontworpen met de eerste geconditioneerde cellen getest in vivo³⁰. Kort, Morgan en zwart getest verschillende combinaties van elektrische en mechanische stimuli, melden dat de timing tussen stimulaties was van cruciaal belang omdat vertraagde gecombineerde elektromechanische stimulatie de beste resultaten-^{28 leverde}. Vervolgens Godier-Furnémont en medewerkers geoptimaliseerd een elektromechanische stimulatie-protocol voor de gemanipuleerde hart spier constructies van neonatale rat hart cellen en bereikt, voor de eerste keer, een positieve kracht-frequentie relatie²⁹. Daarna, onze fractie gerapporteerd dat electromechanically geconditioneerde cellen verhoogd de uitdrukking van de belangrijkste cardiale markeringen in vitro en brede gunstige effecten in vivo, zoals verbeterde cardiale functie of toegenomen dichtheid van het vaartuig in het infarct grens regio³⁰. De meest recente publicatie aangetoond dat cardiale weefsels uit stamcellen-cell-derived cardiomyocytes aan elektromechanische conditionering bereikt een rijping niveau dichter bij menselijke volwassen cardiale structuur en functie^{31 onderworpen}. Bovendien, alternatieve driedimensionale stimulatie platformen omvatten electroactive steigers waarmee de elektrische, mechanische en topografische signalen naar de cellen gekoppeld³². Mechanische vervorming (cel enkelgelaagde uitrekken en compressie) kan bovendien ook worden opgewekt met elastische elektroden nabootsen van normale fysiologische omstandigheden, evenals extreme omstandigheden³³.

De grondgedachte is derhalve dat in vitro elektromechanische prikkels op basis van fysiologische omstandigheden zou kunnen het potentieel van de cardiomyogenic van een cel vergroten. Inderdaad, deze stimulatie kan profiteren verder integraties van therapeutische cellen in het myocardium in een klinische scenario of weefsel rijping voor drug-screening toepassingen te verhogen.

Bovendien, we geïsoleerd en een bevolking van menselijk vetweefsel afkomstige voorlopercellen van cardiale gekenmerkt oorsprong (cardiale ATDPCs)³⁴. Deze cellen bevinden zich in het epicardial vet. Deze cellen weergeven histopathologisch en functionele voordelen bij de behandeling van een hartinfarct en ook het onderhouden van cardiale en endotheel differentiatie potentiële. ^{30 , 35}. wij veronderstelde dat deze voordelen na biofysische stimulatie verhogen zou.

Dus we ontwikkelde een apparaat en een regeling van de stimulatie voor de bevolking van de cel van belang en onderzocht de effecten. Dit elektromechanische protocol is een nieuwe strategie voor het opwekken van actieve cel die zich uitstrekt in een steriele wijze en noninvasively vergeleken met eerdere publicaties³⁶, in combinatie met elektrische veld stimulatie. De techniek hier gemeld wordt uitgelegd in detail het apparaat en de methode die wordt gebruikt voor de elektrische, mechanische en elektromechanische stimulatie van cellen.

Dit apparaat kan bieden zowel elektrische en mechanische stimulatie, onafhankelijk of gelijktijdig. De stimulatie wordt uitgevoerd met een noninvasive en aseptische nieuwe benadering, die presterilized cel ondersteunt, elektroden geplaatst binnen een standaard cultuur plaat, en een platform dat induceert de mechanische en elektrische krachten (Figuur 1).

Het platform kan houden tot zes cultuur platen en bestaat uit een sandwich constructie van laser-gesneden poly(methyl methacrylate) en printplaat stukken. Het prototype platform is gebaseerd op een combinatie van een monofasische programmeerbare computer gestuurde elektrische stimulator, een Printplaat voor de robuuste aansluiting van de elektroden, en zes 10 mm x 10 x 5 mm vernikkeld neodymium-vaste magneten geplaatst in de buurt van de één-kant van de platen van de cultuur. Er is ook een aluminium bar met zes drijvende magneten (hetzelfde model) voor de andere kant van de cultuur-platen geplaatst en vertrok met een lineaire servomotor. De motor wordt aangedreven door een motorcontroller, beheerd via een RS-232 poort door commerciële software (Zie de Tabel van de materialen). Via de gebruikersinterface en programmeerbare stimulator is het mogelijk om te programmeren van de elektrische intensiteit, de impulstijd en frequentie, de frequentie van mechanische stimulatie, de taakcyclus, het aantal pulsen, de amplitude van de pols (magneet excursie), en de helling.

Figuur 1 : Elektromechanische stimulator. (A) PDMS-constructie voor de conditionering van de cel gebruikt. (B) een tekening van het PDMS construct, met inbegrip van de elektroden en magneten. (C) Detail van de printplaat (platform) gebruikt voor het uitvoeren van de elektromechanische conditionering. Dit paneel is gewijzigd van Llucià-Valldeperas et al.³⁰. (D) foto van de elektromechanische stimulatie platform en de user interface (computer). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Zowel de stimulator en de methode voor elektromechanische conditioning zijn volledig beschreven in twee internationale patenten, WO-2013185818-A1³⁷ en³⁸van de WO-2017125159-A1.

De biocompatibel siliconen constructies ontworpen om structurele steun geven aan cellen, elektroden, en magneten zijn geweest beschreven eerder^10,21. Kortom, ze bestaan uit Polydimethylsiloxaan (PDMS), gegoten en genezen bij kamertemperatuur, met een Youngs modulus van 1.3 MPa, dicht bij de fysiologische niveaus. De constructie bevat een cel cultuur zwembad in een flexibele ruimte (10 x 10 x 2 mm), twee innerlijke transversale “slots” om te houden van de elektroden, en twee ingesloten 6 x 2 mm x 4 mm vernikkeld neodymium-magneten. De elektroden zijn gebouwd met 0,2 mm platina-draad twisted rond een 2 x 3 mm x 12 mm polytetrafluorethyleen (PTFE) kern bar (21 cm per elektrode, ongeveer 23 bochten) en aan weerszijden van de flexibele ruimte maken van een elektrisch veld voor inducerende geplaatst elektrische stimulatie. Mechanische uitrekken wordt bereikt door magnetische aantrekkingskracht tussen magneten ingebed in de steun en externe magneten geplaatst naast de cultuur-plaat en op de bewegende aluminium arm. Op deze manier, kan de cel ondersteuning worden uitgebreid zonder verbreking van de steriele barrière. Deze aanpak is geschikt voor een cel enkelgelaagde maar kon worden aangepast aan de driedimensionale constructies, ook.

Bovendien zou een regelmatig patroon ingeprinte waar de cellen worden overgeënt, met behulp van een gelinieerde diffractie raspen (1.250 groeven/mm). De directe visualisatie van de cellen gekweekt op het PDMS construct onder helderveld en fluorescente microscopen is mogelijk omwille van de transparantie en de 0.5 mm dikte. In het onderhavige geval heeft het PDMS cultuur zwembad een verticale oppervlaktepatroon, loodrecht op de uitrekkende force, de cellen loodrecht naar het elektrische veld, die het verloop van het elektrisch veld in de cel minimaliseert uitgelijnd.

Figuur 1 toont een detailbeschrijving van de constructie en het apparaat dat wordt gebruikt voor de stimulatie. De PDMS construeren en kenmerken zijn geoptimaliseerd voor mobiele rekken (figuur 1A, B). De stimulator is ontwikkeld en gevalideerd voor de effectieve toepassing van de gewenste elektrische en mechanische stimulatie naar cellen die zijn gekoppeld aan de PDMS construct. Dit proces omvat zorgen voor goede connectiviteit en gebruiker operability via de interface van de software (Figuur 1 c, D).

De procedure voor stimulatie van de cel met behulp van dit hulpmiddel naar maat wordt beschreven in de sectie protocol.

Protocol

Deze studie maakt gebruik van menselijke cardiale ATDPCs van monsters van de patiënt. Hun gebruik is goedgekeurd door de lokale ethische Commissie, en alle patiënten gaf geïnformeerde toestemming. Het studie-protocol voldoet aan de beginselen die zijn uiteengezet in de verklaring van Helsinki. 1. voorbereiding Autoclaaf twee pincet, 12 platina PTFE-meet-elektroden elektrische stimulatie en sommige papieren handdoeken, bij 121 ° C gedurende 20 minuten. Sterilise…

Representative Results

Figuur 2 geeft het algemene schema gevolgd voor de stimulatie van de cel. Cellen werden kort, ontpit op het PDMS construct en onderworpen aan elektromechanische stimulatie, met een verandering van de media uitgevoerd tweemaal per week. Nonstimulated cellen werden gebruikt als een besturingselement voor de elektromechanische conditionering. Bovendien, we een extra besturingselement toegevoegd aan het experiment en onderhuids ATDPCs werden gebruikt als een best…

Discussion

Elektromechanische stimulatie lijkt te zijn een veilig alternatief voor voorbereiden op een vijandige omgeving van de cardiale cellen en verbetering van hun cardiale inzet. Hier, een protocol beschreven voor cardiale voorlopercellen verhoogd de expressie van belangrijkste cardiale markers en was gemeld dat zij heilzaam zijn voor hun volgende implantatie op infarcted lymfkliertest myocard³⁰. Electromechanically gestimuleerd cardiale ATDPCs verhoogd in het algemeen, de uitdrukking van de genen gerel…

Materials

Stimulator
nickel plated neodymium magnets	Supermagnete	Q-10-10-05-N
nickel-plated neodymium magnets	Supermagnete	Q-06-04-02-HN
polydimethylsiloxane (PDMS) SYLGAR 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corp	184
ruled diffraction grating (1250 grooves/mm)	Newport	05RG150-1250-2
Motor controller	Faulhaber	MCLM-3006-S
Labview	National Instruments
Cell culture
phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	70013-065
0.05% trypsin-EDTA	Gibco	25300-120
35 mm cell culture dish	BD Falcon	45353001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10270-106
L-Glutamine 200 mM, 100x	Gibco	25030-024
Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mL	Gibco	15140-122
Minimum essential medium eagle (alfa-MEM)	Sigma	M4526-24x500ML
Protein & RNA analyses
protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306
AllPrep RNA/Protein Kit	Qiagen	50980404
Rneasy mini kit	Qiagen	74104
iTaq Universal Probes One-Step Kit	Bio-Rad Laboratories	172-5140
Random hexamers	Qiagen	79236
TaqMan PreAmp MasterMix 2X	Applied Biosystems	4391128
TaqMan Universal PCR MasterMix	Applied Biosystems	4324018
Immunostaining
10% formalin	Sigma	HT-501128-4L
horse serum	Sigma	H1138
Triton X-100	Sigma	X100-500ML
Bovine Serum Albumina (BSA)	Sigma	A7906-100G
PARAFILM	Sigma	P6543
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma	D9542
Phalloidin Alexa 568	Invitrogen	A12380
sodium azide	Sigma	S8032-100g
Hoechst 33342	Sigma	14533
Connexin-43 rabbit primary antibody	Sigma	C6219 lot#061M4823
sarcomeric α-actinin mouse primary antibody	Sigma	A7811 lot#080M4864
GATA-4 goat primary antibody	R&D	AF2606 VAZ0515101
MEF2 rabbit primary antibody	Santa Cruz	sc-313 lot#E0611
SERCA2 goat primary antibody	Santa Cruz	sc-8095 lot#D2709
Cy3 secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	711-165-152
Cy3 secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	715-165-151
Cy3 secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	712-165-150
Cy2 secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	715-225-150
Cy2 secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	711-225-152
Cy2 secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	705-225-147