Summary
Burada, üç tüp bebek deneyleri kullanarak insan Trofoblast hücreleri hücre hareketinde değerlendirmek için son derece erişilebilir bir iletişim kuralı mevcut: sıfırdan tahlil, transwell istila tahlil ve Hücre proliferasyonu tahlil.
Abstract
Hücre hareketi bir kritik trophoblasts plasental geliştirme ve erken gebelik sırasında özelliğidir. Uygun Trofoblast göç ve işgal önemini anne damarlara yetersiz Trofoblast işgali ile ilişkili olan gebelik bozuklukları öncesi eklampsi ve intrauterin büyüme kısıtlama gibi gösterilmiştir. Ne yazık ki, anlayışımızı mekanizmaları hangi plasenta tarafından geliştirir geçiş--dan trophoblasts sınırlıdır. Hücre göç sıfırdan tahlil ile in vitro analiz Trofoblast göçmen kapasitesini düzenleyen etkenler belirlenmesinde yararlı bir araçtır. Ancak, bu tahlil yalnız değişmiş hücre göç neden olabilir hücresel değişikliklerin tanımlamaz. Bu iletişim kuralı topluca Trofoblast hücre hareketi değerlendirmek için kullanılan üç farklı tüp bebek deneyleri açıklar: sıfırdan tahlil, istila tahlil ve nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil. Burada açıklanan protokoller de bizi canlı tutan hücre hareketinde ölçmek için diğer hücre hatlarında kullanılmak değiştirilebilir. Bu yöntemler müfettişler bireysel faktörler hücre hareketine katkıda bulunmak ve potansiyel mekanizmaları hücre göç belirgin değişiklikler temel alınan bir muayene sağlar tanımlamak olanak sağlar.
Introduction
Plasental geliştirme gebelik, maternal ve fetal sağlığı etkileyen kurulması çok önemli bir adımdır. Ancak, bu işlem tarafından oluştuğu mekanik olarak tam olarak anlaşılamamıştır. Hücre göç kurulması ve plasenta fonksiyonları için hamilelik sırasında yaptığı katkının önemli bir biyolojik süreçtir. Blastosist implantasyonu, Korionik villus yüzeyine kapak ve gaz ve besin değişimi dahil olan, villous trophoblasts, ve dışarı villus göç extravillous trophoblasts (EVTs), trophectoderm ayırır ve anne decidua ve damarlara1istila. EVTs geçirilmesi anne spiral arterler remodeling ve fetal büyüme2desteklemek için uteroplacental dolaşım kurulması için esastır. Yetersiz Trofoblast işgali sırasında gebelik gebelik komplikasyonları preeklampsi, Gestasyonel hipertansiyon, intra uterin büyüme kısıtlama ve erken doğum3gibi katkıda ve anormal plasental geliştirme sonuçları, 4. Bu nedenle, Trofoblast hareketliliği etkileyen faktörleri anlamak için normal placentation gerekli yollar belirlemek için önemlidir.
Trofoblast geçiş sinyal molekülleri, büyüme faktörleri, sitokinler, hormonlar ve anjiogenik faktörler5de dahil olmak üzere karmaşık bir ağı tarafından kontrol edilir. Plasenta içinde vivo eğitim sınırlamaları nedeniyle, tüp bebek deneyleri kullanan insan Trofoblast hücre hatları Trofoblast hareketliliği için katkıda faktörleri belirlemek için çok önemli olmuştur ölümsüzleştirdi. Sıfırdan ve işgal deneyleri kapsamlı kantitatif Trofoblast hücre göç6,7,8bireysel moleküllerin rolünü değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ancak, tandem nasıl geçiş değişiklikleri değişiklikleri tarafından hücre invasiveness neden olabilir araştırmak için yararlı iken bu iki deneyleri değişmiş hücre geçiş oranları için katkıda bulunabilir ek mekanizmaları için hesap değil. Örneğin, hücre çoğalması oranının indirimleri daha az hücrelerde geçirmek kullanılabilir neden olabilir.
Burada, çizik, hücre çoğalması ve hücre işgali deneyleri kullanarak Trofoblast geçişi değerlendirmek için kantitatif tüp bebek yöntemleri açıklanmaktadır. Sıfırdan tahlil tek tip bir yara bir hücre monolayer oluşturulur ve geçiş hücre boşluğu doldurmak için otomatik, hızlandırılmış görüntüleme yara boyutu ve yoğunluğu yara içindeki hücreleri tarafından ölçülür. Hücre çoğalması tahlil hücreler hücreleri bilinen başlangıç miktarı karşılaştırıldığında her zaman noktasında oranını hesaplamak üzerinde temel alır. Cep işgali tahlil hücreleri bir hücre dışı matriks kaplı hücre kültür Ekle Odası (örneğin Transwell) tohumlari ve yanıt olarak kemoterapi-cezbedici hücre dışı matriks ile istila hücre sayısı dikkate alınır.
Kazı-kazan tahlil ne kadar farklı çevre koşulları belirlemek için kullanılan basit ve etkili bir araç etkileyen hücre geçiş olduğunu. Nükleer silahların yayılmasına karşı ve işgal deneyleri daha sonra hücre çoğalması ve invasiveness hücre göç genel değişikliklere katkısını belirlemek için kullanılır. Toplu olarak, bu deneyleri hücre hareketliliği için katkıda bulunabilir biyolojik süreçlerin sağlam ölçümler sağlamak. İki ölümsüzleştirdi birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre satır açıklanan deneyleri, Swan.71 (Sw.71) ve HTR-8/SVneo9,10kullanılmıştır. Ancak, bu deneyleri de hücre göç ve işgal anahtar modülatörler tanımlamak için diğer hücre tipleri kullanmak için optimize.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hücre hazırlık
- T-75 şişeler 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem oranı, standart büyüme medyada hücreleri korumak.
Not: Bu deneylerde kullanılan hücre ölümsüzleştirdi vardı birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları Swan.71 (Sw.71) ve HTR-8/SVneo9,10. Sw.71 hücre DMEM/F-%12 10 ısı inaktive fetal sığır serum (FBS), 1.0 mM sodyum pyruvate, 10 mM HEPES, 0.10 mM MEM esansiyel olmayan amino asitler, 100 adet/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile desteklenmiş muhafaza. HTR-8/SVneo hücre RPMI-1640 %5 ile desteklenmiş saklanır ısı-inaktive FBS. - 90-%100 izdiham ulaşana kadar çoğaltmak hücreleri izin. Steril doku kültürü akışı kukuIeta kullanarak, steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 10 mL şişe ve yıkama hücrelerle medyadan Aspire edin.
- PBS Aspire edin ve 1 (% 0.05) x 5 mL ekleyin Tripsin-EDTA hücreleri tripsin tarafından tutulduğundan emin yapma şişesi için. Tüm hücreleri şişeye (yaklaşık 5-10 dk) altından ayırdıktan kadar 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem muhafaza laboratuvar kuluçka şişeye koyun.
- Önceden ısıtılmış büyüme ortamının 10 mL tripsin-EDTA devre dışı bırakmak için balonun ekleyin.
2. sıfırdan tahlil
- Adım 1.4, tohum % 100 izdiham 48 h ulaşmak için 24-şey plaka hücrelere uygun sayıda takip.
Not: Kazı-kazan tahlil çeşitli farklı plaka düzenler ile gerçekleştirmek mümkündür. Kuyu yara maker aracı tarafından izin verilen en fazla sayısını bir 96-şey biçimidir. - Ertesi gün (bir gün önce sıfırdan tahlil), medya ısı inaktive, kömür dextran elimden FBS dahil olmak üzere gerektiği gibi takıma fenol kırmızısı boş ortam için değiştirin.
Not: Diğer çalışmalar düşük konsantrasyon FBS (örneğin, % 1) ile medya kullanımı tavsiye Bu iletişim kuralı11alternatif olarak kullanılan hücre çoğalması en aza indirmek için. - Kazı-kazan tahlil günü, hücreler 30 dk için istenilen tedavi her şey medya ekleyerek pretreat. Anahattı hazırlanmış deneyler araç (1 x PBS) ve 1 x PBS içinde seyreltilmiş 100 nM deksametazon kullanılmaktadır.
-
Tek tip yaralar oluşturmak için steril 10 µL pipet ipucu yara maker aracı iğne yerleştirin. İpuçları Wells ilk satıra düşürebilir ve pipet ipuçları iyi diğer tarafına ulaşmak kadar plaka yara maker parça boyunca taşıyın.
- Plaka alt plaka kuyu çapı arasında yara bir sabit emin olmak için sürekli dokunmak pipet ipuçları izin başlangıç pozisyonuna geri taşıyın. Kaldırmak ve yerine steril 10 µL pipet ipuçları ve ipuçları wells sonraki satır düşük.
- Bütün wells çizik kadar 2.4 tekrarlayın.
Not: Bir yara maker aracı yoksa, yaralar el ile wells 10 µL pipet ucu ile Merkezi kazıma oluşturulabilir. - Dikkatli bir şekilde medya Aspire edin ve yavaşça hücreleri iki kez 1 x PBS ile yıkayın. Son bir yıkama desteklenmiştir fenol kırmızısı ücretsiz, soyulmuş ya da istenilen tedavi ya da (2.3. adımda belirtilen şekilde) araç düşük-FBS medya ekleyin.
Not: 1 x PBS ile yıkama ayırmak hücreleri neden olur HTR-8/SVneo hücreleri desteklenmiştir fenol kırmızısı medya ile yıkanmalıdır. - Otomatik, hızlandırılmış Imager içeren çizilmiş wells ( Tablo malzemelerigörmek) yer alan 24-şey plaka 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem muhafaza bir laboratuvar kuluçka yerleştirin. Hücreleri (örneğin, her 2 h için 72 h) yara iyileşmesi tamamlamak izin vermek için gerektiği gibi düzenli aralıklarla görüntü wells.
- Otomatik, hızlandırılmış Imager ile ilişkili yazılım tarafından yara yoğunluğu ve genişliği hesaplayın ( Tablo malzemelerigörmek). Yaranın boyutuna başlangıç yaranın büyüklüğüne göre yüzde değişim hesaplamak için yaranın genişliği 0 zamanında % 100 değerine ayarlayın. Sonraki her timepoint yara boyutunda yaranın büyüklüğüne göre 0 zamanında bölmek ve yüzdesi (şekil 1) elde etmek için 100 ile çarpmak.
3. Invasion tahlil
- Aşağıdaki adım 1.4, tohum hücre hücreleri % 90 izdiham içinde 48 h. koru hücreleri 37 ° C, % 5 CO2, % 95 nem ayarlı bir laboratuvar kuluçka ulaşmak izin vermek için 6-şey tabak içine uygun bir sayı.
- Ertesi gün, medya ısı inaktive, kömür dextran elimden FBS dahil olmak üzere gerektiği gibi takıma fenol kırmızısı boş ortam için değiştirin.
Not: Hücreleri bağlı olarak deneysel tasarım şu anda pretreated. - Şu anda 10 mg/mL hücre dışı matriks şişe yerleştirin ( Tablo reçetesibakın) ve buz buzdolabında gecede çözülme izin.
- Ertesi gün, önceden serin işgali tahlil 24-şey plakaları yerleştirerek kaynakları, microcentrifuge tüpleri ve pipet İpuçları (4 ° C) buzdolabında en az 2 h önce hücre dışı matriks ile çalışan için hücre kültürü ekler.
- Doku kültürü mahallede soğutulmuş malzemeleri kullanarak, 10 mg/mL hücre dışı matriks fenol red ücretsiz, serum-Ücretsiz medya için 5 mg/mL nihai bir konsantrasyon ile 1:1 oranında seyreltin.
Not: Her zaman hisse senedi ve seyreltilmiş hücre dışı matriks buz üzerinde tutun. Hücre dışı matriks medyaya oranını assay olarak kullanılan hücre satır özelliklerini göre ayarlanabilir. - Doku kültürü mahallede soğutulmuş malzemeleri kullanarak, seyreltilmiş hücre dışı matriks 100 μL 24-şey plaka yerleştirilir ekler ( Tablo malzemelerigörmek) ekleyin. Matrix olmadan herhangi bir kabarcıklar düzeyi olduğundan emin olun. 24-şey plaka içeren matris kaplı yer kuluçka 37 ° C'de matris sertleşmesine izin vermek için ekler.
- Hücreleri istila tahlil için hazırlık için hücreleri 1 mL 1 x PBS ile yıkayın, PBS Aspire edin ve her şey için 1 x tripsin-EDTA 500 µL ekleyin. 6-şey plaka tüm hücreleri kalenin altından ayırdıktan kadar 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem muhafaza laboratuvar kuluçka yerleştirin.
- Hücreleri ayırdıktan sonra fenol-kırmızı-free, serum-Ücretsiz medya 500 µL trypsinized hücreleri her şey için ekleyin.
- Microcentrifuge tüp ve aşağı spin vasıl 400 x g 4 ° C'de 5 min için 1.000 µL müstakil hücre transfer
- Medya Aspire edin ve fenol red ücretsiz, serum-Ücretsiz medya hücrelerde resuspend (birim hücre konsantrasyonu bağlı olacaktır). Otomatik bir hücre kullanarak hücreleri hesaplama ( Tablo malzemelerigörmek) counter ve hücre süspansiyon için 5 x 10 mL başına5 hücre son bir konsantrasyon seviyesini ayarlamak.
Not: Bir hemasitometre ve mikroskop hücreleri saymak için kullanılabilir. - Tam büyüme ortamının 600 μL işgali tahlil için kullanılacak olan 24-şey plaka kuyu ekleyin.
Not: Ek chemoattractants veya tedavi tam büyüme orta iyi (alt Kamara) eklenebilir. Anahattı hazırlanmış deneyler araç (1 x PBS) veya 1 x PBS alt odasına içinde seyreltilmiş 100 nM deksametazon eklendi. - Yer önceden kaplanmış işgali tahlil için kullanılacak tam büyüme orta içeren her şey eklemek. Daha sonra hücre üstünde tepe-in her önceden kaplanmış hücre ekleme (üst Kamara) 1 x 105 hücreleri olmak üzere toplam 200 μL ekleyin.
Not: Bu tahlil için bir negatif kontrol, fenol-kırmızı-Alerjik, serum-özgür medya (olmadan hücreleri) eşit bir hacmi üst odasına eklenebilir. - 24-şey plaka 37 ° C, % 5 CO2ve 24 saat için % 95 nem muhafaza laboratuvar kuluçka yerleştirin.
Not: 24 saat kuluçka dönemi ölümsüzleştirdi birinci üç aylık dönem Trofoblast hücreleri için optimize edildi ve daha fazla testler diğer hücre hatlarında gerekli kuluçka süresi belirlemek için gerekli. - Gecede kuluçka alt ve üst odası kalan ortamdan hücre dışı matriks bozmadan emme gerek. Sonra dikkatli bir şekilde işgal olmayan hücreleri ve hücre dışı matriks INSERT hücre dışı matriks kaldırmak için gereken birçok kez ev temizliği bir pamuklu çubukla ile üst bölümünü kaldırın.
- Yıkama her 3 x 1 x PBS, her iki üst ve alt odaları iyi için PBS ekleme ile ekleyin. PBS her yıkama sonra Aspire edin.
- Ekler için % 100 buz gibi metanol 4 ° C'de 30 dk için içine ekler yerleştirerek bağlı hücreleri tamir Final yıkadıktan sonra yıkama 3 x 1 x PBS ve Kaldır PBS ile ekler. % 20 etanol içinde % 0,2 kristal violet ile 10 min için ekler bağlı hücreler leke.
- 3 x deiyonize suyla durulayın ve deiyonize suyla sonra son yıkama Aspire edin.
- Oda sıcaklığında 1 h için ekler kuruması. Forseps ve jilet kullanarak, ucun alt membran dikkatle kesin ve alt yüzü yukarı bakacak şekilde bir cam slayt üzerinde monte. Montaj medya oda sıcaklığında kurumasını sağlar.
- 20 x amacı ile hafif bir mikroskop kullanarak örnek başına baskına hücrelerin en az 4 benzersiz görüntü elde. Her görüntü hücrelerde toplam sayısını ve örnekleri kontrol etmek ve verileri (Şekil 2) çizmek hücre sayısı normale.
4. nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil
- Aşağıdaki adım 1.4, bir otomatik hücre sayaç balonun üzerinden trypsinized hücreleri saymak ve 6-şey plakaları standart büyüme medya bir kuyu başına 2 x 105 hücre yoğunluğu, içine tohum.
- Yer hücreleri 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem hücreleri kadar veya 4 h için tutulan bir laboratuvar kuluçka yapıştırılır.
- Fenol kırmızısı renginde değişiklik ortama ısı inaktive, kömür dextran elimden FBS dahil olmak üzere özgür gerektiği gibi desteklenen medya ve istenilen tedavi ekleyin. Anahattı hazırlanmış deneyler araç (1 x PBS) veya 1 x PBS içinde seyreltilmiş 100 nM deksametazon eklendi. 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem muhafaza bir laboratuvar kuluçka 6-şey tabak koyun.
- Medyayı çıkarın ve yeni medya ve tedavi ile her 48 h değiştirin.
- 24, 48 ya da 72 h tedavi sonra hücreleri 1 mL 1 x PBS ile yıkayın ve tripsin-EDTA 500 µL her şey için ekleyin. Hücreleri tabaktan ayırdıktan kadar 6-şey plaka kuluçka makinesine koyun.
- Hücreleri plaka ayırdıktan sonra 500 µL tripsin devre dışı bırakmak için ilave fenol kırmızısı Ücretsiz medya ekleyin.
- Trypsinized hücre 5 µL için ayrı bir tüp Trypan mavi 5 µL ve pipetting tarafından karıştırın.
- Bir otomatik hücre sayaç kullanarak yinelenen her kuyudan hücreleri saymak.
- Evet, her zaman nokta ve arsa başına hücre sayısı zaman (şekil 3) bir fonksiyonu ortalama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları Sw.71 ve HTR-8/SVneo bu deneylerde glukokortikoid Trofoblast hücre geçiş12rolünü belirlemek için kullanılmıştır. Ne alternatif tedaviler kullanılan12olabilir onlar son zamanlarda Trofoblast işlevler, alter gösterilmiştir gibi sebepler bu deneylerde kullanılıyordu. Her iki hücre hatları araç (1 x PBS) veya 100 ile tedavi edilen tüm deneyler için sentetik glukokortikoid deksametazon (Dex) nM. Yara yoğunluğu ve boyutu her 2 h için 72 h otomatik, hızlandırılmış bir görüntüleme sistemi kullanılarak ölçüldü. Şekil 1 bir örnek görüntü ve farklı timepoints, kazı-kazan tahlil elde edilen sonuçları göstermektedir. 0, 8 ve 18 h timepoints her iki tedaviler için örnek görüntüleri (şekil 1A) temin edilmiştir. Yara yoğunluğu ve yaranın boyutu örnekleri araç kontrol (olsun) veya 100 ile tedavi için zaman içinde grafiği çizilecek nM Dex (şekil 1B). Dex tedavi yara yoğunluğu ve yaranın boyutu, glukokortikoid birinci üç aylık dönem Trofoblast hücreleri hücre göç inhibe belirten tarafından belirlenen yara kapatma oranını azalttı.
Şekil 2 Invasion tahlil takip hücre kültür ekleme çekilen görüntüleri bir örneği gösterilir. Hücreleri Veh veya 100 ile 24 h için tedavi nM Dex. Baskına hücreleri tedavi dört benzersiz alanları bakış REPLICATE başına başına dört bağımsız çoğaltır üzerinden sayıldı. Glukokortikoid tedaviye hücre invasiveness, baskına hücre sayısı % 15 azalma görüldüğü gibi azaltılmış.
Şekil 3 Hücre proliferasyonu tahlil bir örneği gösterilir. Hücreleri sayılır 24, 48 ve 72 h olsun veya 100 ile tedavi aşağıdaki nM Dex. Glukokortikoid tedaviye, her zaman bir noktada daha az hücreleri tarafından belirtildiği gibi hücre çoğalması, azaltılmış. Genel olarak, bu deneyleri glukokortikoid pozlama hücre çoğalması ve işgal engelleyerek hücre hareketliliği azaltır göstermektedir.
Şekil 1: hücre sıfırdan tahlil. (A)yaralar için Veh - ve Dex-0, 8 ve 18 h Sw.71 hücreleri gösterilir tedavi temsilcisi görüntülerini. Kırmızı çizgiler yara boyutu belirtir. (B) yara yoğunluğu ve yaranın boyutu ölçülür araç (olsun) veya 100 ile tedavi Sw.71 ve HTR-8/SVneo hücrelerdeki nM Dex. Fotoğraf her 2 h 72 h otomatik, hızlandırılmış bir mikroskop kullanarak için çekildi. Verileri temsil eden dört bağımsız çoğaltır ± SEM ortalaması Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: hücre işgali tahlil. İstila deneyleri yapılan araç (olsun) veya 100 ile 24 h için tedavi Sw.71 ve HTR-8/SVneo hücrelerle nM Dex. (A)işgali tahlil olsun ve Dex tedavi hücrelerin 24 h kuluçka sonra temsilcisi görüntülerden. İç metin görüntü ile üst odasına ekledi hiçbir hücre negatif denetimidir. 200 x büyütme oranında çekilen görüntüleri. Ölçek çubukları vardır 120 µm. (B) Invaded hücre sayılan ve çubuk grafikler dört bağımsız çoğaltır ± SEM normalleştirilmiş ortalamasını temsil Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Hücre proliferasyonu tahlil. SW.71 ve HTR-8/SVneo hücreleri tedavi ile araç (olsun) ya da 100 nM Dex 24 her bir otomatik hücre sayaç h sayılan. En az 11 bağımsız ortalama ± SEM çoğaltır gibi hücre sayısı grafiği çizilecek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yordamı geçiş ve işgal kullanımı deneyleri hücre çoğalması Trofoblast hücre hareketi ölçülen farklılıkları için potansiyel bir katkı olarak değeri oluşturur. Birlikte bu tüp bebek deneyleri Trofoblast geçişi düzenleyen hücresel yolları tanımlamak için kullanılan basit ve etkili yöntem kullanılır. Yukarıda açıklandığı gibi Trofoblast hücreleri hormonlar, sitokinler, büyüme faktörleri veya Trofoblast hareket üzerindeki etkilerini belirlemek için diğer molekülleri ile tedavi edilebilir. Alternatif olarak, hedef proteinlerinin fonksiyonel rollerinin Trofoblast hareketliliği aydınlatmak hücrelerden tükenmiş. Anahtar modülatörler Trofoblast göç tanımlayan temel komplikasyonlar gebelik preeklampsi, intrauterin büyüme kısıtlama ve erken doğum gibi plasental hatalarına karşı ilgili temel mekanizmaları daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir.
Doğru sonuçlar elde etmek için gerekli olan birkaç kritik adım bu protokolü vardır. Fenol kırmızısı hücre kültür medya13' te kullanılan konsantrasyonlarda östrojenik aktivite olduğundan, o fenol kırmızısı boş ortam için deneysel bitiş noktaları östrojen reseptör hücreleri içinde istenmeyen aktivasyonu önlemek için kullanılır önemlidir. Transwell işgali tahlil sırasında hücre dışı matriks homojen, düz ve soğuk malzemeleri matris erken polimerizasyon engellemek için kullanılır emin olmak önemlidir. Hücre çoğalması ve işgal deneyleri iletken örnekleri hemen re-bağlılık hücrelerin doku kültürü plakaları için önlemek için saymak önemlidir. Bu da göz altında hücre ölümü nedeniyle deneysel tedavi sonuçları tüm üç deneyleri, etkileyebilir alınmalıdır. Bu nedenle, hücre ölüm (örneğin, laktat dehidrogenaz yayın, Fosfatidilserin dışa veya DNA bozulması) tedaviye yanıt işaretleri geçiş, değerlendirilmesi önce deneysel hücre doğrultusunda değerlendirilmesi gerekir işgali, ve nükleer silahların yayılmasına karşı14. Bu deneyleri için bazı sınırlamalar var, örneğin, bir hücre yaralanma yanıt hücre geçiş işleminin yıkmak daha bir yara bir hücre monolayer oluşturma işlemi neden olmaktadır. Ayrıca, tek tip yara genişlikleri oluşturur bir yara-maker araç kullanan kısmen bu sınırlama azaltabilir, ancak el ile kazıma interexperiment değişkenliği, neden olabilir. İstila tahlil bir bitiş noktası tahlil olduğunu ve Kinetik hareketinin kolayca elde değil dezavantajdır. Bu sınırlamaları rağmen burada açıklanan deneyleri tekrarlanabilir, nicel veri sağlamak nispeten düşük maliyetli.
Her ne kadar bu deneyleri yapışık olmayan hücre tipleri için uygun olmaz burada açıklanan deneyleri de hücre göç diğer hücre tipleri ölçmek için değiştirilebilir. Kazı-kazan tahlil görüntüleme aralıkları hızlandırılmış mikroskopi için yeterince hücre göç oranı farklılıkları yakalamak için ayarlanabilir. Canlı hücre görüntüleme için otomatik sistemler yara boyutu görüntüler sık sık her 15 dk. 30 en az her dk çekilen görüntüleri olarak birlikte yara iyileşmesi bir film oluşturmak için dikişli yakalayabilirsiniz. İstila tahlil, hücre dışı Matriks, konsantrasyon hücreleri toplam sayısı tohumlari ve sabitleme ve hücre sayım önce kuluçka uzunluğu hesabına farklı hücre tipleri'ı işgal belirli oranı için ayarlanabilir. Hücre proliferasyonu tahlil için farklı hücre büyüme oranlarının hesabına plakaları ve Hücre sayımı için zaman Puan üzerine numaralı seribaşı hücre sayısı ayarlanabilir. Genel olarak, bu deneyleri hücre tipleri geniş bir hücre göç temel mekanizmaları tanımlamak için kullanılan esnek ve son derece erişilebilir araçları vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Dr. Gil Mor Sw.71 hücreleri verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu araştırma bir Albert McKern bilim adamı Ödülü S.W. tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
References
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 21, S25-S30 (2000).
- Norwitz, E. R. Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications. Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).
- Ness, R. B., Sibai, B. M. Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).
- Knöfler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).
- Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells. Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).
- Nadeem, L., et al. Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).
- Onogi, A., et al. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy. Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).
- Straszewski-Chavez, S. L., et al. The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71. Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).
- Graham, C. H., et al. Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan. Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71. American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12 18 (2004).
