विट्रो में प्रवास का मूल्यांकन करने के लिए assays, आक्रमण, और अमर मानव के प्रसार के पहले-trimester ट्रोफोब्लास्ट सेल लाइनों
Summary
खरोंच परख, transwell आक्रमण परख, और सेल प्रसार परख: यहां, हम मानव ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं में सेल आंदोलन का मूल्यांकन करने के लिए एक उच्च सुलभ प्रोटोकॉल वर्तमान में तीन विट्रो assays में का उपयोग कर ।
Abstract
कोशिका संचलन प्लेसेंटल विकास और प्रारंभिक गर्भावस्था के दौरान ट्रोफोब्लास्ट का एक महत्वपूर्ण गुण है । उचित ट्रोफोब्लास्ट माइग्रेशन और आक्रमण के महत्व को गर्भावस्था के विकारों जैसे प्री-एक्लैम्पसिया और इंट्रायूटरिन विकास प्रतिबंध के द्वारा प्रदर्शित किया जाता है, जो मातृ वैक्लचर के अपर्याप्त ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण से जुड़े होते हैं । दुर्भाग्य से, तंत्र के बारे में हमारी समझ जिसके द्वारा प्लेसेंटा माइग्रेट ट्रोफोब्लास्ट से विकसित होता है सीमित है । में खरोंच परख के माध्यम से सेल प्रवास के विट्रो विश्लेषण कारकों की पहचान करने में एक उपयोगी उपकरण है कि ट्रोफोब्लास्ट प्रवासी क्षमता को विनियमित है । हालांकि, इस परख अकेले सेलुलर परिवर्तन है कि बदल सेल प्रवास में परिणाम कर सकते है परिभाषित नहीं करता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन तीन विट्रो assays में अलग है कि सामूहिक रूप से उपयोग किया जाता है ट्रोफोब्लास्ट सेल आंदोलन का मूल्यांकन: खरोंच परख, आक्रमण परख, और प्रसार परख । यहां वर्णित प्रोटोकॉल भी अन्य कोशिका लाइनों में उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है करने के लिए उत्तेजना के जवाब में सेल आंदोलन यों तो. इन पद्धतियों जांचकर्ताओं व्यक्तिगत कारकों है कि सेल आंदोलन में योगदान की पहचान करने और सेल प्रवास में स्पष्ट परिवर्तन अंतर्निहित संभावित तंत्र की एक पूरी तरह से परीक्षा प्रदान करने के लिए अनुमति देते हैं ।
Introduction
गर्भनाल विकास गर्भावस्था की स्थापना में एक महत्वपूर्ण कदम है, दोनों मातृ और भ्रूण स्वास्थ्य को प्रभावित । हालांकि, यंत्रवत आधार जिसके द्वारा यह प्रक्रिया होती है पूरी तरह से समझ में नहीं आता है । सेल माइग्रेशन एक महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रिया है जो गर्भावस्था के दौरान प्लेसेंटा की स्थापना और कार्यों में योगदान देती है । ब्लास्टोसिस्ट प्रत्यारोपण के बाद, trophectoderm, जो चोरोनिक विली की सतह को कवर और गैस और पोषक तत्वों के आदान-प्रदान में शामिल हैं, और extravillous ट्रोफोब्लास्ट्स (evts), जो विली से बाहर पलायन में विलेउस trophoविस्फोटों में differentiates और मातृ पाती और vasculature1आक्रमण । evts के प्रवास मातृ सर्पिल धमनियों remodeling और भ्रूण विकास2का समर्थन करने के लिए uteroplacental परिसंचरण की स्थापना के लिए आवश्यक है । गर्भावस्था के दौरान अपर्याप्त ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण असामान्य अपरा विकास में परिणाम और गर्भावस्था जटिलताओं के लिए योगदान कर सकते हैं जैसे preeclampsia, गर्भावधि उच्च रक्तचाप, अंतर-गर्भाशय विकास प्रतिबंध, और अपरिपक्व जन्म3, 4. इसलिए, उन कारकों को समझना जो ट्रोफोब्लास्ट गतिशीलता को प्रभावित करते हैं, सामान्य placentation के लिए आवश्यक रास्ते का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है ।
ट्रोफोब्लास्ट माइग्रेशन को संकेतन अणुओं के एक जटिल नेटवर्क द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसमें वृद्धि कारक, साइटोकिन्स, हार्मोन, और एंजिजेनिक कारक5शामिल हैं । vivo में अपरा का अध्ययन करने की सीमाओं के कारण, इन विट्रो assays में अमर मानव ट्रोफोब्लास्ट सेल लाइनों का उपयोग कारकों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है जो ट्रोफोब्लास्ट गतिशीलता में योगदान देते हैं । खरोंच और आक्रमण assays के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है मात्रात्मक ट्रोफोब्लास्ट सेल माइग्रेशन6,7,8पर व्यक्तिगत अणुओं की भूमिका का आकलन । हालांकि, इस बात की जांच करने के लिए अग्रानुक्रम में उपयोगी है कि माइग्रेशन में परिवर्तन कक्ष असावधानी में परिवर्तन के कारण कैसे हो सकते हैं, इन दो assays अतिरिक्त मेकेनिज़्म के लिए नहीं खाते जो कक्ष माइग्रेशन की परिवर्तित दरों में योगदान कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, सेल प्रसार की दर में कटौती के परिणामस्वरूप कम कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए उपलब्ध हो सकता है ।
यहाँ, हम खरोंच, कोशिका प्रसार, और सेल आक्रमण assays का उपयोग कर ट्रोफोब्लास्ट माइग्रेशन का आकलन करने के लिए विट्रो तरीकों में मात्रात्मक का वर्णन. खरोंच परख में, एक समान घाव एक सेल मोनोलेयर में बनाया जाता है, और अंतर को भरने के लिए कोशिकाओं के प्रवास को स्वचालित, घाव के आकार और घाव के भीतर कोशिकाओं के घनत्व के समय-चूक इमेजिंग द्वारा मापा जाता है । सेल प्रसार परख कोशिकाओं की एक ज्ञात प्रारंभिक मात्रा की तुलना में हर समय बिंदु पर कोशिकाओं के अनुपात की गणना पर आधारित है । सेल आक्रमण परख में, कोशिकाओं के ऊपर एक extracellular मैट्रिक्स-लेपित सेल संस्कृति डालने के चैंबर (जैसे transwell), और कोशिकाओं की संख्या कि chemo के जवाब में extracellular मैट्रिक्स के माध्यम से आक्रमण-आकर्षी गिना जाता है वरीयता प्राप्त कर रहे हैं ।
खरोंच परख एक सरल और प्रभावी उपकरण है कि कैसे विभिंन पर्यावरणीय स्थितियों सेल प्रवास को प्रभावित निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रसार और आक्रमण assays बाद सेल प्रसार के योगदान को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और कोशिका प्रवास में समग्र परिवर्तन करने के लिए invasiveness । सामूहिक रूप से, इन assays जैविक प्रक्रियाओं है कि कोशिका गतिशीलता के लिए योगदान कर सकते हैं की मजबूत माप प्रदान करते हैं । दो अमर पहले trimester ट्रोफोब्लास्ट सेल लाइनों वर्णित assays में इस्तेमाल किया गया, हंस. 71 (Sw. 71) और htr-8/svneo9,10. हालांकि, इन assays भी सेल प्रवास और आक्रमण की कुंजी नियन्त्रक की पहचान करने के लिए अन्य सेल प्रकार में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रक्रिया माइग्रेशन और आक्रमण assays के उपयोग पर बनाता है कोशिका प्रसार की दर को एक संभावित योगदानकर्ता के रूप में शामिल करने के लिए ट्रोफोब्लास्ट सेल आंदोलन में मापा मतभेद । एक साथ इस्तेमाल किया, इन वि?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक दप. 71 कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के लिए डॉ गिल मोर धंयवाद । इस शोध को एक अल्बर्ट mckern विद्वान पुरस्कार द्वारा समर्थित था S.W.
Materials
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
References
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 21, S25-S30 (2000).
- Norwitz, E. R. Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications. Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).
- Ness, R. B., Sibai, B. M. Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).
- Knöfler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).
- Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells. Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).
- Nadeem, L., et al. Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).
- Onogi, A., et al. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy. Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).
- Straszewski-Chavez, S. L., et al. The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71. Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).
- Graham, C. H., et al. Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan. Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71. American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2004).
