Tests in Vitro pour évaluer la Migration, Invasion et la prolifération de lignées cellulaires immortalisées humaine au premier trimestre trophoblaste
Summary
Nous présentons ici un protocole très accessible pour évaluer le mouvement cellulaire dans les cellules Trophoblastiques humaines à l’aide de trois essais in vitro : le test de gratter, le dosage d’invasion de transwell et le test de prolifération cellulaire.
Abstract
Mouvement cellulaire est une propriété essentielle de trophoblastes durant le développement placentaire et début de grossesse. Les troubles de la grossesse tels que la restriction de croissance intra-utérine et de la prééclampsie, qui sont associés à l’invasion du trophoblaste inadéquate du système vasculaire maternelle attestent l’importance de la migration correcte de trophoblaste et invasion. Malheureusement, notre compréhension des mécanismes par lequel le placenta se développe de migrer trophoblaste est limitée. Analyse in vitro de la migration cellulaire via le dosage zéro est un outil utile pour identifier les facteurs qui régissent la capacité migratoire de trophoblaste. Toutefois, ce test seul ne définit pas les modifications cellulaires qui peuvent se traduire par la migration des cellules altérées. Ce protocole décrit trois différents essais in vitro utilisés collectivement pour évaluer le mouvement des cellules Trophoblastiques : le test de gratter, le dosage de l’invasion et le test de prolifération. Protocoles décrits ici peuvent également être modifiées pour utilisation dans les autres lignées de cellules afin de quantifier le mouvement cellulaire en réponse à des stimuli. Ces méthodes permettent d’identifier les facteurs individuels qui contribuent à la circulation de cellules et d’effectuer un examen approfondi des mécanismes éventuels changements apparents dans la migration cellulaire, les enquêteurs.
Introduction
Développement placentaire est une étape cruciale dans la mise en place de la grossesse, un impact sur la santé maternelle et fœtale. Toutefois, les bases mécanistiques par lesquels ce processus se produit ne sont pas entièrement comprise. La migration cellulaire est un processus biologique important qui contribue à la mise en place et les fonctions du placenta pendant la grossesse. Après l’implantation du blastocyste, le trophectoderme se différencie en villositaire trophoblastes, qui recouvrent la surface des villosités choriales et sont impliqués dans l’échange de nutriments et de gaz, et de trophoblaste extravilleux (tte), qui migrent à partir des villosités et envahissent la caduque et le système vasculaire maternelle1. Migration de la tte est essentielle pour remodelage des artères spirale maternelle et établissant la circulation utéro pour soutenir la croissance foetale2. Invasion du trophoblaste insuffisants pendant la grossesse se traduit par un développement anormal placentaire et peut-être contribuer à des complications de la grossesse comme la pré-éclampsie, hypertension gravidique, restriction de croissance intra-utérine et prématurité3, 4. Comprendre les facteurs qui affectent la motilité trophoblaste est donc essentiel de déterminer les voies nécessaires à placentation normale.
Migration de trophoblaste est contrôlée par un réseau complexe de molécules, y compris les facteurs de croissance, les cytokines, les hormones et de facteurs angiogéniques5de signalisation. En raison des limitations de l’étude du placenta in vivo, essais in vitro utilisant immortalisé les cellules Trophoblastiques humaines lignes ont été essentielles pour identifier les facteurs qui contribuent à la motilité de trophoblaste. Essais sur zéro et invasion ont été utilisés intensivement pour évaluer quantitativement le rôle des molécules individuelles sur trophoblaste cell migration6,7,8. Cependant, bien qu’utiles en tandem pour étudier comment des changements dans la migration peuvent être causés par des changements dans envahissant de la cellule, ces deux tests ne tiennent pas compte des mécanismes supplémentaires qui peuvent contribuer à des taux altérés de la migration cellulaire. Par exemple, des réductions du taux de prolifération cellulaire peuvent entraîner moins de cellules disponibles à migrer.
Nous décrivons ici les méthodes in vitro quantitatives pour l’évaluation de migration de trophoblaste à l’aide de scratch, prolifération cellulaire et analyses d’invasion cellulaire. Dans l’essai de gratter, une plaie uniforme est créée dans une monocouche de cellules, et la migration des cellules pour combler le vide est mesurée par imagerie automatisée, time-lapse de la taille de la plaie et la densité des cellules au sein de la plaie. Le test de prolifération cellulaire est basé sur le calcul du ratio de cellules à chaque point dans le temps par rapport à une quantité connue de départ des cellules. Dans l’essai d’invasion cellulaire, les cellules sont ensemencées au sommet d’une chambre d’insertion culture cellulaire d’enduit de matrice extracellulaire (p. ex. Transwell), et le nombre de cellules qui envahissent par le biais de la matrice extracellulaire en réponse à la chimio-attractant est compté.
L’essai de scratch est un outil simple et efficace qui peut être utilisé pour déterminer comment les différentes conditions environnementales affectent la migration cellulaire. Les prolifération et invasion épreuves peuvent par la suite être utilisées pour déterminer la contribution de la prolifération cellulaire et son caractère invasif à l’évolution globale de la migration cellulaire. Collectivement, ces tests fournissent des mesures robustes des processus biologiques qui peuvent contribuer à la motilité cellulaire. Deux lignées de cellules immortalisées trophoblaste au premier trimestre ont été utilisées dans les essais décrits, la Swan.71 (Sw.71) et la HTR-8/SVneo9,10. Toutefois, ces tests peuvent également être optimisés pour dans d’autres types de cellules pour identifier les principaux modulateurs de la migration cellulaire et l’invasion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette procédure s’appuie sur l’utilisation de la migration et l’invasion des essais afin d’inclure le taux de prolifération cellulaire comme un facteur potentiel de différences mesurées dans le mouvement de cellules Trophoblastiques. Utilisés ensemble, ces essais in vitro sont des méthodes simples et efficaces qui peuvent servir à identifier les voies cellulaires qui régulent la migration de trophoblaste. Comme décrit ci-dessus, cellules Trophoblastiques peuvent être traitées avec des hormones, cytokin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Dr Gil Mor pour fournir les cellules Sw.71. Cette recherche a été financée par une bourse de chercheur de McKern Albert à S.W.
Materials
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
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