Test in Vitro per valutare la migrazione, invasione e la proliferazione di linee cellulari immortalizzate umano primo-acetonide Trophoblast
Summary
Qui, presentiamo un protocollo altamente accessibile per valutare il movimento delle cellule in cellule del trofoblasto umano utilizzando tre saggi in vitro: l’analisi di gratta e Vinci, l’analisi di invasione di transwell e l’analisi di proliferazione delle cellule.
Abstract
Movimento delle cellule è una proprietà critica di trofoblasto durante lo sviluppo placenta e la gravidanza iniziale. Il significato del trofoblasto corretta migrazione e l’invasione è dimostrato da disturbi di gravidanza come restrizione della crescita intrauterina e di pre-eclampsia, che sono associati con l’invasione del trofoblasto inadeguata del vasculature materno. Purtroppo, la nostra comprensione dei meccanismi da cui la placenta si sviluppa dalla migrazione trofoblasto è limitato. Analisi in vitro di migrazione delle cellule via l’analisi gratta e Vinci sono uno strumento utile nell’identificazione dei fattori che regolano la capacità migratoria trofoblasto. Tuttavia, questo test da solo non definisce i cambiamenti cellulari che possono provocare la migrazione cellulare alterata. Questo protocollo descrive tre diversi saggi in vitro utilizzati collettivamente per valutare il movimento delle cellule di trofoblasto: il dosaggio di gratta e Vinci, l’analisi di invasione e il saggio di proliferazione. I protocolli descritti qui possono essere modificati anche per l’uso in altre linee cellulari per quantificare il movimento cellulare in risposta agli stimoli. Questi metodi consentono ai ricercatori di identificare fattori individuali che contribuiscono al movimento delle cellule e forniscono un esame approfondito dei meccanismi potenziali cambiamenti apparenti nella migrazione cellulare.
Introduction
Sviluppo placenta è un passo fondamentale nella creazione della gravidanza, un impatto di salute sia materna che fetale. Tuttavia, la base meccanicistica per cui questo processo avviene completamente non è capita. Migrazione delle cellule è un processo biologico importante che contribuisce alla costituzione e funzioni della placenta durante la gravidanza. A seguito dell’impianto di blastocisti, delle cellule trofoblastiche differenzia in trofoblasti villosi, che coprono la superficie dei villi coriali e sono coinvolti in gas e lo scambio di nutrienti, ed extravillous trofoblasto (EVTs), che migrano fuori da villi e invadere la materna decidua e sistema vascolare1. Migrazione del EVTs è essenziale per rimodellamento arterie a spirale materna e circolazione uteroplacentare per supportare la crescita fetale2. Invasione del trofoblasto inadeguata durante la gravidanza provoca lo sviluppo placenta anormale e può contribuire alle complicanze della gravidanza come la preeclampsia, ipertensione gestazionale, restrizione della crescita intrauterina e nascita pretermine3, 4. Di conseguenza, comprensione dei fattori che influiscono sulla motilità di trofoblasto è essenziale per determinare i percorsi necessari per placentazione normale.
Migrazione di trofoblasto è controllata da una complessa rete di molecole, tra cui fattori di crescita, citochine, ormoni e di fattori angiogenici5di segnalazione. A causa delle limitazioni di studiare la placenta in vivo, saggi in vitro utilizzando immortalato delle cellule del trofoblasto umano linee sono stati essenziali per identificare i fattori che contribuiscono alla motilità del trofoblasto. Analisi zero e di invasione sono stati ampiamente utilizzate per valutare quantitativamente il ruolo delle singole molecole il trofoblasto cella migrazione6,7,8. Tuttavia, mentre utile in tandem per indagare come cambiamenti nella migrazione possono essere causati da cambiamenti nell’invasività delle cellule, questi due test non conto di ulteriori meccanismi che possono contribuire a alterato i tassi di migrazione delle cellule. Ad esempio, riduzioni del tasso di proliferazione delle cellule possono provocare meno cellule disponibili per la migrazione.
Qui, descriviamo metodi quantitativi in vitro per la valutazione della migrazione di trofoblasto utilizzando zero, proliferazione delle cellule e le analisi di invasione delle cellule. Nell’analisi della memoria virtuale, una ferita uniforme viene creata in un monostrato di cellule e la migrazione delle cellule per colmare il divario è misurata da formazione immagine automatizzata, time-lapse della dimensione della ferita e densità delle cellule all’interno della ferita. L’analisi di proliferazione delle cellule è basato sul calcolo del rapporto delle cellule in ogni punto di tempo rispetto ad una quantità nota di partenza delle cellule. Nell’analisi di invasione delle cellule, cellule sono seminate in cima a un alloggiamento di inserto della coltura cellulare rivestite con matrice extracellulare (ad es. Transwell) e il numero di cellule che invadono attraverso la matrice extracellulare in risposta alla chemio-attractant è contato.
Il dosaggio zero è uno strumento semplice ed efficace che può essere utilizzato per determinare come le diverse condizioni ambientali influiscono sulla migrazione delle cellule. I saggi di proliferazione ed invasione possono essere utilizzati successivamente per determinare il contributo di proliferazione delle cellule e l’invasività di cambiamenti globali nella migrazione cellulare. Collettivamente, questi saggi forniscono misurazioni robusti dei processi biologici che possono contribuire alla motilità cellulare. Due linee cellulari immortalizzate primo-acetonide trofoblasto sono state utilizzate nelle analisi descritte, Swan.71 (Sw.71) e HTR-8/SVneo9,10. Tuttavia, queste analisi possono anche essere ottimizzate per l’utilizzo in altri tipi cellulari per identificare la chiave modulatori della migrazione cellulare e invasione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questa procedura si basa sull’uso di migrazione e invasione saggi per includere il tasso di proliferazione delle cellule come un potenziale collaboratore di differenze misurate nel movimento delle cellule di trofoblasto. Utilizzati insieme, questi saggi in vitro sono metodi semplici ed efficaci che possono essere utilizzati per identificare le vie cellulari che regolano la migrazione di trofoblasto. Come descritto in precedenza, le cellule del trofoblasto possono essere trattate con ormoni, citochine, fattori di crescita…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. Gil Mor per fornire le cellule di Sw.71. Questa ricerca è stata sostenuta da un Albert McKern Scholar Award a S.W.
Materials
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
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