移行, 侵略, と不死化妊娠初期絨毛細胞の増殖を評価する生体外の試金
Summary
ここでは、3 つの生体外の試金を使用して絨毛細胞における細胞運動を評価するため非常にアクセス プロトコルを提案: スクラッチ アッセイ、transwell 浸潤アッセイと細胞増殖アッセイ。
Abstract
細胞運動は胎盤発育、妊娠初期に絨毛トロホブ ラストの重要なプロパティです。適切な栄養の移行と侵略の意義が母体の血管の不十分な栄養膜浸潤と関連付けられる子癇前症と子宮内の成長の制限など妊娠障害によって実証します。残念ながら、メカニズムの理解、胎盤を移行するから開発されるトロホブは制限。スクラッチのアッセイによる細胞遊走の in vitro 解析は、絨毛渡り鳥容量を規制する要因を識別するに便利なツールです。ただし、本法だけでは変えられた細胞の移動につながる携帯電話の変更を定義しません。このプロトコルは、まとめて使用して絨毛細胞運動を評価する 3 つの異なる体外の試金を記述する: スクラッチ アッセイ、浸潤能の測定と拡散の試金。ここで説明されているプロトコルは、刺激に応じて細胞運動を定量化する他の細胞で使用するため修正されるかもしれません。これらのメソッドは、細胞運動に貢献し、潜在的なメカニズムで細胞変化の徹底的な検査を提供する個々 の要因を識別するために研究者を許可します。
Introduction
胎盤発育、妊娠、母体と胎児の健康に影響を与えるの確立の重要なステップです。ただし、このプロセスが発生するメカニズムの基礎は完全には理解されていません。細胞遊走は妊娠成立と胎盤の機能に貢献する重要な生物学的プロセスです。胚盤胞移植後, 栄養外胚葉は絨毛トロホブ、絨毛膜絨毛の表面をカバーし、ガスと栄養の交換に関与していると絨毛から移行を外トロホブ (EVTs) に区別します。母体の脱落膜と血管系1に侵入します。EVTs の移行は母体らせん動脈を改造して胎児の成長2をサポートする子宮循環を確立するために不可欠です。妊娠中に不十分な栄養膜浸潤異常胎盤の発育結果し、子癇前症、妊娠高血圧症候群や子宮内の成長の制限、早産3などの妊娠合併症に貢献するかもしれない 4。したがって、絨毛運動に影響を与える要因を理解することは、通常胎盤に必要な経路を決定するのに不可欠です。
胎盤絨毛細胞の移行は、細胞、成長因子、サイトカイン、ホルモン、血管新生因子5などの複雑なネットワークによって制御されます。体内の胎盤を勉強の制限のための in vitro アッセイを利用したラインは絨毛運動に寄与する要因を特定することが重要されている絨毛細胞を不死化。傷や浸潤アッセイは、絨毛細胞移行6,7、8に個々 の分子の役割を定量的に評価するため広く使用されています。ただし、タンデム移行の変化を細胞侵襲性の変更によって引き起こされるかもしれない方法を調査するために便利ですが、これらの 2 つの試金は細胞遊走の変更の率に貢献するかもしれない追加のメカニズムを説明しません。たとえば、移行に利用できるより少ないセル細胞増殖率を削減可能性があります。
ここでは、スクラッチ、細胞増殖、細胞浸潤アッセイを使用して栄養移行を評価するための定量体外法について述べる。スクラッチのアッセイで制服傷は単層の細胞で作成され細胞のギャップを埋めるための移動は、創傷サイズの自動、タイムラプス イメージングと創内の細胞の密度で測定します。セル拡散の試金はセルの既知の開始量と比較して各時点でのセルの比率の計算に基づいています。細胞浸潤アッセイの細胞が細胞外マトリックス コート細胞培養挿入室 (例えば Transwell) 上にシードし、化学誘引物質への応答における細胞外マトリックスを介して侵入する細胞数がカウントされます。
スクラッチのアッセイは、細胞の移動に影響を与えるどのように異なる環境条件を決定するために使用可能性がありますシンプルで効果的なツールです。増殖と浸潤アッセイは、続いて細胞増殖と細胞移動の全体的な変化に侵襲性の寄与を決定する使用されるかもしれない。総称して、これらの試金は細胞の運動性に貢献するかもしれない生物的プロセスの堅牢な測定を提供します。2 つの不死化妊娠初期絨毛細胞ラインは説明アッセイ、Swan.71 (Sw.71)、HTR-8/SVneo9,10で使用されました。ただし、これらの試金はキー変調器の細胞の遊走・浸潤を識別する他の細胞型での使用にも最適化可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
この手順は、絨毛細胞運動の計測違いに潜在的な貢献者として細胞増殖率を含めるアッセイ移行および侵略の使用に基づいています。一緒に使用すると、これらの生体外の試金は、絨毛の移行を調節する細胞の経路を識別するために使用することができますシンプルで効果的な方法です。前述のように、栄養膜細胞は、ホルモン、サイトカイン、成長因子、または絨毛運動に与える影響を決?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、博士 Gil Mor が Sw.71 細胞を提供することをありがちましょう。この研究は、南西にアルバート McKern 学者賞によって支えられました。
Materials
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
References
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