마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서
Summary
여기, 우리는 3 개의 생체 외 분석 실험을 사용 하 여 인간의 trophoblast 셀에 셀 운동 평가 위한 매우 액세스할 수 있는 프로토콜 제시: 스크래치 분석 결과, transwell 침략 분석 결과 및 세포 확산 분석 실험.
Abstract
셀 운동은 placental 개발 및 임신 초기 동안 trophoblasts의 중요 한 속성 이다. 적절 한 trophoblast 마이그레이션 및 침략의 중요성 모성 맥 관 구조의 부적당 한 trophoblast 침공과 관련 된 사전 eclampsia 및 자궁내 성장 제한 같은 임신 장애에 의해 증명 됩니다. 불행히도, 메커니즘의 우리의 이해는 태에서 마이그레이션 개발 trophoblasts 제한 됩니다. 스크래치 분석 결과 통해 셀 이동의 생체 외 분석 trophoblast 철새 용량을 조절 하는 요소 식별에 유용한 도구입니다. 그러나, 혼자이 분석 결과 변경 된 셀 이동에서 발생할 수 있는 세포 변화를 정의 하지 않습니다. 이 프로토콜 설명 trophoblast 셀 운동 평가를 공동으로 사용 되는 세 가지 다른 생체 외 분석 실험: 스크래치 분석 결과, 침공 분석 결과 및 확산 분석 결과. 여기에 설명 된 프로토콜 계량 셀 운동 자극에 대 한 응답에서을 다른 셀 라인에 사용 하기 위해 수정할 수 있습니다. 이 메서드는 셀 운동에 기여 하 고 기본 셀 마이그레이션에 명백한 변경 잠재적인 메커니즘의 철저 한 검사를 제공 하는 개별 요소 식별에 조사 수 있습니다.
Introduction
Placental 발달은 임신, 산 모와 태아 모두 건강에 영향을 미치는의 설립에 중요 한 단계 이다. 그러나, 기계적으로이 프로세스는 발생 합니다 완전히 이해 하지는. 셀 마이그레이션 임신 중의 태 반 기능과 설립에 기여 하는 중요 한 생물 학적 과정 이다. Blastocyst 주입, 다음은 trophectoderm villous trophoblasts 융 villi의 표면을 커버 하 고 가스 및 영양소 교환에 관련 된, 그리고는 villi에서 마이그레이션할 extravillous trophoblasts (EVTs)으로 차별화 그리고 침략 모성 decidua 및 맥 관 구조1. EVTs의 마이그레이션 모성 나선형 동맥을 개장 하 고 태아 성장2를 지 원하는 uteroplacental 순환 설정에 대 한 필수적입니다. 임신 중 부족 trophoblast 침공 비정상적인 태 반 개발 결과 자간 전 증, 임 신성 고혈압, 자 궁 내 성장 제한, 조산3, 등 임신 합병증에 기여할 수 있습니다. 4. 따라서, trophoblast 운동에 영향을 주는 요소를 이해 정상적인 placentation에 필요한 경로 결정 하는 것이 필수적입니다.
Trophoblast 마이그레이션 신호 분자, 성장 인자, cytokines, 호르몬, 신생 요인5등의 복잡 한 네트워크에 의해 제어 됩니다. Vivo에서 태 반 연구의 제한으로 인해 활용 생체 외 분석 실험 불후 인간의 trophoblast 셀 라인 trophoblast 운동에 기여 하는 요소를 식별 하는 중요 한 되었습니다. 스크래치 및 침입 분석 양적 trophoblast 셀 마이그레이션6,,78에 개별 분자의 역할을 평가 하기 위해 광범위 하 게 사용 되었습니다. 그러나, 어떻게 변화 마이그레이션에 의해 발생할 수 있습니다 변경 셀 침입에 조사에 유용한,이 두 개의 분석 셀 마이그레이션 변경 된 요금에 기여할 수 있는 추가적인 메커니즘에 대 한 계정을 하지 않습니다. 예를 들어 마이그레이션할 수 적은 세포 세포 확산의 속도를 감소 발생할 수 있습니다.
여기, trophoblast 마이그레이션 스크래치, 세포 증식, 세포 침입 분석 실험을 사용 하 여 평가 하기 위한 정량 생체 외에서 방법을 설명 합니다. 스크래치 분석 결과에서 균일 한 상처 셀 단층에서 만들어지고 격차를 채우기 위해 셀의 마이그레이션 자동화, 시간 경과 상처 크기의 영상과 상처 내의 세포의 조밀도 의해 측정 된다. 셀 확산 분석 결과 셀의 알려진된 시작 수량에 비해 각 시간 지점에서 세포의 비율을 계산 기준으로 합니다. 셀 침공 분석 결과, 세포는 세포 외 매트릭스 코팅 셀 문화 삽입 챔버 (예: Transwell), 위에 시드 그리고 항 암 치료-유인에 기질을 통해 침입 하는 셀의 수 계산 됩니다.
스크래치 분석 결과 어떻게 다른 환경 조건을 결정 하는 데 사용할 수 있는 간단 하 고 효과적인 도구 셀 마이그레이션에 영향을 미칠 것 이다. 침공과 확산 분석 실험 이후에 세포 확산과 침입 셀 마이그레이션에 전반적인 변화에의 기여를 확인 하려면 사용할 수 있습니다. 샨 다, 이러한 분석 셀 운동에 기여할 수 있는 생물 학적 프로세스의 강력한 측정을 제공 합니다. 2 개의 불멸 하 게 첫 임신 trophoblast 셀 라인 HTR-8/SVneo9,10, Swan.71 (Sw.71) 기술된 분석에서 사용 되었다. 그러나, 이러한 분석 셀 이동과 침략의 주요 변조기를 식별 하기 위해 다른 셀 형식에 사용 하기 위해 최적화 또한 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 절차는 마이그레이션 및 침략의 사용 trophoblast 셀 운동 측정된 차이에 잠재적인 참가자로 셀 확산의 속도 포함 분석 실험 바탕. 함께 사용이 생체 외 분석 실험은 trophoblast 마이그레이션 조절 세포 경로 식별 하기 위해 사용할 수 있는 간단 하 고 효과적인 방법입니다. 위에서 설명한 대로 호르몬, cytokines, 성장 인자, 또는 다른 분자 trophoblast 운동에 미치는 영향을 확인 하려면 trophoblast 세포를 치…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 박사 길 Mor Sw.71 세포를 제공 감사 합니다. 이 연구는 남서에 앨버트 McKern 학자 포상에 의해 지원 되었다
Materials
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
References
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