L'esame quantitativo di suscettibilità antibiotica nei test di Neisseria gonorrhoeae aggregati utilizzando ATP-utilizzazione commerciale Live/Dead macchiatura
Summary
Un’analisi di ATP-misurazione semplice e live/dead metodo di colorazione sono stati usati per quantificare e visualizzare le gonorree di Neisseria sopravvivenza dopo il trattamento con ceftriaxone. Questo protocollo può essere esteso per esaminare gli effetti antimicrobici di qualsiasi antibiotico e può essere utilizzato per definire la concentrazione inibitoria minima di antibiotici in biofilm batterici.
Abstract
L’emergere di resistenti agli antibiotici Neisseria gonorrhoeae (GC) è una minaccia per la salute in tutto il mondo e mette in evidenza la necessità di identificare gli individui che non riescono di trattamento. Questo batterio gram-negativo causa gonorrea esclusivamente in esseri umani. Durante l’infezione, è in grado di formare aggregati e/o biofilm. Il test di concentrazione inibitoria minima (MIC) è utilizzato per determinare la suscettibilità agli antibiotici e di definire il trattamento adatto. Tuttavia, il meccanismo di eradicazione in vivo e la sua relazione ai risultati di laboratorio non sono noti. È stato sviluppato un metodo che esamina come aggregazione di GC influisce sulla sensibilità agli antibiotici e illustrata la relazione tra dimensioni di aggregazione e di sensibilità agli antibiotici. Quando aggregato GC, sono più resistenti agli antibiotici uccisione, con batteri nel centro della sopravvivenza ceftriaxone trattamento meglio di quelli in periferia. I dati indicano che l’aggregazione di N. gonorrhoeae può ridurre la sua suscettibilità a ceftriaxone, che non trova riscontro utilizzando i metodi MIC basati su piastra di agar standard. Il metodo utilizzato in questo studio permetterà ai ricercatori di testare la suscettibilità batterica in condizioni clinicamente rilevanti.
Introduction
La gonorrea è che una comune infezione (STI)1trasmesse per via sessuale. Neisseria gonorrhoeae (GC), un batterio gram-negativo diplococcal, è l’agente eziologico di questa malattia. I sintomi dell’infezione genitale possono provocare dolore durante la minzione, dolore genitale generalizzato e scarico uretrale. L’infezione è spesso asintomatica2,3,4,5, e in questo modo estesa colonizzazione. Queste infezioni non trattate sono un problema sanitario importante, come hanno il potenziale per facilitare la trasmissione dell’organismo e questo può portare a complicazioni come la malattia infiammatoria pelvica (PID) e diffuso l’infezione gonococcica (DGI)6. Gonorrea resistente agli antibiotici è una crisi di salute pubblica e un crescente onere socio-economico7. Ridotta sensibilità alle cefalosporine ha provocato il cambiamento di regime di trattamento da un singolo antibiotico a duplice terapia, che combina azitromicina o doxiciclina con ceftriaxone8. Il guasto aumentato di ceftriaxone e azithromycin9,10, in combinazione con le infezioni asintomatiche, evidenzia l’esigenza di comprendere gli insuccessi del trattamento di gonorrea.
La prova di concentrazione inibitoria minima (MIC), tra cui agar diluizione e disco test di diffusione, è stata usata come la prova medica standard per l’identificazione di resistenza ad un antibiotico. Tuttavia, non è chiaro se il MIC test riflette la resistenza antibiotica batterica in vivo. La formazione di biofilm batterici contribuisce alla sopravvivenza di batteri in presenza di concentrazioni battericide di antibiotico: il MIC Test è in grado di rilevare questo effetto11. Perché GC può formare biofilm su superfici mucose12, possiamo ipotizzare che tale antibiotico suscettibilità all’interno di aggregati sarebbe diverso da quello visto in GC individuali. Inoltre, gli studi hanno indicato che la proteina molecole di superficie variabile, Pili, opacità (Opa) a tre fasi, e lipooligosaccharides (LOS), che regolano le interazioni inter-batterio, portare a diversi aggregati di dimensioni13, 14 , 15. il contributo di questi componenti di resistenza agli antibiotico non è stato esaminato a causa della mancanza di metodi adeguati.
Attualmente, ci sono diversi metodi per misurare l’eradicazione biofilm. Il metodo quantitativo più ampiamente usato è misurando i cambiamenti nella biomassa usando cristalvioletto macchiatura16. Tuttavia, il metodo richiede significativi manipolazione sperimentale, che potenzialmente possa generare errori in esperimento ripetizioni17. Il metodo di macchiatura live/dead qui utilizzato permette la visualizzazione di batteri vivi e morti e loro distribuzione all’interno del biofilm. Tuttavia, la struttura di biofilm può rappresentare come una barriera fisica che riduce la penetrazione della tintura. Pertanto, per quantificare i batteri vive/morte all’interno di un gruppo, la colorazione è limitata a piccole biofilm oppure il suo precursore-microcolonies o aggregazioni. Altri metodi, compreso le prove di diffusione agar diluizione e disco, non sono in grado di misurare gli effetti dell’aggregazione. Per esaminare la suscettibilità di GC all’interno di aggregazione dopo esposizione agli antibiotici, un metodo ideale avrebbe bisogno di avere entrambi un dosaggio quantitativo che può misurare batteri vivi e visualizzare la loro distribuzione.
La procedura qui descritta combina una misurazione di ATP-utilizzazione e un live/dead colorazione dosaggio a quantitativamente ed esaminare visivamente la suscettibilità di GC all’interno di aggregati in presenza di antibiotici.
Protocol
Representative Results
Discussion
I batteri possono formare biofilm durante l’infezione del corpo umano. Test di MIC tradizionale potrebbe non riflettere la concentrazione necessaria per sradicare i batteri nel biofilm. Per verificare gli effetti antimicrobici su un biofilm, metodi basati sulla biomassa di biofilm, nonché CFUs di placcatura possono essere errati a causa dell’impatto della struttura del biofilm. Ad esempio, il metodo di placcatura funziona solo se il biofilm può essere interrotta. Quindi, il CFU ottenuto può essere inferiore rispetto a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal National Institute of Health D.C.S e W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., ed E.N. sono stati sostenuti in parte/partecipare al programma “Il primo anno l’innovazione & ricerca Experience” finanziato dall’Università del Maryland. I finanziatori non avevano alcun ruolo in studio progettazione, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Riconosciamo l’UMD CBMG Imaging Core per tutti gli esperimenti di microscopia.
Materials
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
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