Un simple test ATP-instruments de mesure et vivre/morts méthode de coloration ont été utilisés pour quantifier et visualiser les Neisseria gonorrhoeae survie après traitement par ceftriaxone. Ce protocole peut être étendu pour examiner les effets antimicrobiens de n’importe quel antibiotique et peut être utilisé pour définir la concentration minimale inhibitrice d’antibiotiques dans les biofilms bactériens.
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Article de méthode
Examen quantitatif de la sensibilité aux antibiotiques d’essais commerciaux de Neisseria gonorrhoeae utilisation d’ATP à l’aide de granulats et de Live/Dead coloration
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’émergence de résistants aux antibiotiques Neisseria gonorrhoeae (GC) est une menace pour la santé dans le monde entier et souligne la nécessité d’identifier les personnes qui ne respectent pas de traitement. Cette bactérie Gram-négative provoque la gonorrhée exclusivement chez l’homme. Au cours de l’infection, il est apte à former des agrégats ou des biofilms. L’essai de la concentration minimale inhibitrice (CMI) est utilisé pour déterminer la susceptibilité aux antibiotiques et de définir un traitement approprié. Toutefois, le mécanisme de l’éradication in vivo et sa relation avec les résultats de laboratoire ne sont pas connus. A développé une méthode qui examine comment l’agrégation GC affecte la sensibilité aux antibiotique et montre la relation entre la taille des granulats et sensibilité aux antibiotique. Lors de l’agrégat de GC, ils sont plus résistants aux antibiotiques mise à mort, avec des bactéries dans le centre survivant ceftriaxone traitement mieux que ceux de la périphérie. Les données indiquent que l’agrégation de N. gonorrhoeae peut réduire sa sensibilité à la ceftriaxone, qui se traduit pas en utilisant les méthodes MIC standard agar axée sur la plaque. La méthode utilisée dans cette étude permettra aux chercheurs de tester la sensibilité bactérienne conditions cliniquement pertinentes.
Introduction
La gonorrhée est qu'une commune transmises sexuellement (MTS)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), une bactérie Gram-négative de diplococcal, est l’agent causal de cette maladie. Symptômes de l’infection génitale peuvent entraîner des douleurs pendant la miction, douleurs génitales généralisée et urétral. L’infection est souvent asymptomatique2,3,4,5, et cela permet à la longue colonisation. Ces infections non traitées sont un sujet de préoccupation majeur pour la santé, car ils sont susceptibles de faciliter la tra....
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Protocole
1. entretien général des souches de GC
- Les souches de N. gonorrhoeae -ensemencer sur une gélose GCK avec 1 % Kellogg complète18 (tableau 1, tableau 2) provenant des stocks du congélateur et incuber à 37 ° C, avec 5 % CO2 pendant 16 à 18 h. utilisation MS11 exprimant phase variable Opa (MS11Opa +), aucune Opa (MS11ΔOpa), ou a LOS tronqué (MS11ΔLgtE).
- Prélever soigneusement des pili négatif (colonie sans bordure sombre) ou colonies positives (colonie avec bordure sombre) de chaque souche issu de morphologie de colonie19 en utilisant un microscope à lumière dissection....
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Résultats
Deux méthodes ont été employées : un essai d’utilisation ATP et un test de coloration de vivre/morts. Les résultats peuvent être combinés ou utilisés individuellement pour examiner la survie bactérienne au sein des agrégats après un traitement antibiotique. Le test d’utilisation ATP a été démontré pour mesurer des bactéries viables avec précision dans le S. aureus biofilms20,21. Ici, MS11Opa + Lip + souche a permis d’exam.......
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Discussion
Les bactéries peuvent former des biofilms au cours de l’infection du corps humain. Traditionnel MIC test peut-être ne pas refléter la concentration nécessaire pour éradiquer les biofilms bactériens. Pour tester les effets antimicrobiens sur un biofilm, méthodes basées sur la biomasse biofilm ainsi qu’UFC de placage peuvent être erronées en raison de l’impact de la structure des biofilms. Par exemple, la méthode de placage ne fonctionne que si le biofilm peut être perturbé. Par conséquent, l’UFC a obtenu peut être inférie.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une subvention du National Institute of Health D.E.C. et W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., et E.N. appuyés en partie/participer au programme « La première année l’Innovation & recherche expérience » financé par l’Université du Maryland. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans l’étude de conception, collecte de données et l’analyse, de décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Nous reconnaissons l’UMD CBMG Imaging Core pour toutes les expériences de microscopie.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 100x supplément | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay ; | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC base moyenne ; | BD | 228950 | |
| Nitrate ferrique, non hydraté | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Poudre cristalline | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight colorant vivant/mort | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 souche | aimablement fournie par le Dr Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Recherche | ||
| Phosphate de potassium dibasique (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Pepton-protéose ; | BD Biosciences | 211693 | |
| Chlorure de sodium (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Amidon soluble | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Pyrophosphate de thiamine | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Équipement | |||
| Boîtes de Pétri | VWR | 25384-302 | |
| 8 puits lamelle-chambre de fond ; | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| plaques de culture tissulaire à 96 puits | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Classe II, A2 Hotte à flux laminaire) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubateur | Fisher Scientific | ; Modèle 3530 | |
| Microscope confocal équipé d’une chambre d’imagerie en direct | Leica | SP5X | |
| Corning ; Microplaque en polystyrène noir 96 puits ; | Corning | 3904 | |
| Illuminateur Glomax ; | Promega | E6521 | |
| Pointes de pipette (0,1-10 & micro ; L) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pointes de pipette (1000 µ ; L) | VWR | 83007-382 | |
| Pointes de pipette (200 µ ; L) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotomètre Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Tubes coniques stériles 15 ml | VWR | 21008-216 | |
| Tubes microcentrifuges stériles (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Applicateurs stériles à embout polyester | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicateur | Kontes | Equivelent à 9110001 |
Références
- CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorr....
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Réimpressions et autorisations
