Exame quantitativos de susceptibilidade antibiótica de Neisseria gonorrhoeae agregados usando ATP-utilização comercial ensaios e coloração Live/mortos
Summary
Um simples ensaio de medição da ATP e método de coloração ao vivo/morto foram usados para quantificar e Visualizar Neisseria gonorrhoeae sobrevivência após o tratamento com ceftriaxona. Este protocolo pode ser estendido para examinar os efeitos antimicrobianos de qualquer antibiótico e pode ser usado para definir a concentração inibitória mínima dos antibióticos em biofilmes bacterianos.
Abstract
O surgimento de resistentes aos antibióticos Neisseria gonorrhoeae (GC) é uma ameaça para a saúde no mundo e destaca a necessidade de identificar as pessoas que não o tratamento. Esta bactéria Gram-negativa causa a gonorreia exclusivamente em seres humanos. Durante a infecção, é capaz de agregados de forma e/ou biofilmes. O teste de concentração inibitória mínima (CIM) é usado para determinar a susceptibilidade aos antibióticos e definir o tratamento adequado. No entanto, o mecanismo de erradicação em vivo e sua relação com os resultados de laboratório não são conhecidos. Foi desenvolvido um método que examina como GC agregação afeta a susceptibilidade aos antibióticos e mostra a relação entre tamanho de agregação e suscetibilidade aos antibióticos. Quando agregado de GC, são mais resistentes ao antibiótico matar, com bactérias no centro sobrevivendo ceftriaxona tratamento melhor do que aqueles na periferia. Os dados indicam que a agregação de N. gonorrhoeae pode reduzir sua susceptibilidade à Ceftriaxona, que não é reflectida usando os métodos MIC de baseados em placa de ágar padrão. O método utilizado neste estudo permitirá aos pesquisadores testar susceptibilidade bacteriana em condições clinicamente relevantes.
Introduction
Gonorreia é que um comum sexualmente transmissíveis infecção (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), uma bactéria Gram-negativa de diplococcal, é o agente causador da doença. Sintomas de infecção genital podem resultar em dor durante a micção, dor genital generalizada e descarga uretral. Infecção é frequentemente assintomática2,3,4,5, e isto permite a colonização estendida. Estas infecções não tratadas são uma preocupação de saúde importantes, como eles têm o potencial para facilitar a transmissão do organismo e isto pode levar a complicações como doença inflamatória pélvica (DIP) e disseminado de Infecção gonocócica (DGI)6. Resistentes aos antibióticos gonorreia é uma crise de saúde pública e um crescente fardo socioeconômico7. Suscetibilidade reduzida às cefalosporinas, resultou em mudança de regime de tratamento de um único antibiótico a terapia dupla, que combina a azitromicina ou doxiciclina com ceftriaxone8. O maior fracasso de ceftriaxona e azitromicina9,10, em combinação com infecções assintomáticas, destaca a necessidade de compreender as falhas do tratamento de gonorreia.
O teste de concentração inibitória mínima (CIM), incluindo o ágar diluição e disco difusão testes, tem sido usado como o exame médico padrão para a identificação de resistência a um antibiótico. No entanto, não está claro se o MIC teste reflete a resistência antibiótica bacteriana in vivo. A formação de biofilmes bacterianos contribui para a sobrevivência de bactérias na presença de concentrações bactericidas de antibiótico: testando o MIC é incapaz de detectar este efeito11. Porque o GC pode formar biofilmes sobre superfícies mucosas12, nós hypothesize que antibiótico suscetibilidade dentro agregados seria diferente daquele visto no GC individual. Além disso, estudos têm mostrado que trifásico moléculas de superfície variável, Pili, associada a opacidade da proteína (Opa), e lipooligosaccharides (LOS), que regulam interações inter bactérias, conduzir a diferentes agregados tamanho13, 14 , 15. a contribuição destes componentes de resistência aos antibióticos não tem sido examinada devido à falta de métodos apropriados.
Atualmente, existem vários métodos para medir a erradicação do biofilme. O método quantitativo mais amplamente utilizado é medindo as mudanças na biomassa usando cristal violeta mancha16. No entanto, o método requer manipulação experimental significativa, que potencialmente pode gerar erros no experimento repetições17. O método de coloração ao vivo/morto usado aqui permite a visualização de bactérias vivas e mortas e sua distribuição dentro do biofilme. No entanto, a estrutura do biofilme pode posar como uma barreira física que reduz a penetração do corante. Portanto, para quantificar as bactérias ao vivo/morto dentro de um grupo, a coloração é limitada a pequenas biofilmes seu precursor-microcolonies ou agregações. Outros métodos, incluindo os testes de difusão diluição e disco de ágar, não são capazes de medir os efeitos de agregação. Para examinar a susceptibilidade de GC dentro de agregação após a exposição aos antibióticos, um método ideal seria preciso ter ambos um ensaio quantitativo que pode medir vivem bactérias e visualizar sua distribuição.
O procedimento descrito aqui combina uma medição de utilização de ATP e ao vivo/morto coloração do ensaio para quantitativamente e examinar visualmente a susceptibilidade de GC dentro agregados na presença de antibióticos.
Protocol
Representative Results
Discussion
As bactérias podem formar biofilmes durante a infecção do organismo humano. Teste de MIC tradicional pode não refletir a concentração necessária para erradicar as bactérias em um biofilme. Para testar os efeitos de agentes antimicrobianos em um biofilme, métodos baseados em biomassa de biofilme, bem como do chapeamento CFUs podem ser errôneos devido ao impacto da estrutura do biofilme. Por exemplo, o método de chapeamento só funciona se o biofilme pode ser interrompido. Daí, o UFC obtida pode ser menor que o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma concessão do Instituto Nacional de saúde para a Premier e W.S. AI123340. L.-CW, J.W., ar-condicionado, e E.N. foram apoiados em parte/participação no programa de “O primeiro ano inovação & pesquisa experiência” financiado pela Universidade de Maryland. Os financiadores não tinham qualquer papel no estudo design, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Reconhecemos o UMD CBMG Imaging Core para todos os experimentos de microscopia.
Materials
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
References
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
- Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
- Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
- Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , (2011).
- Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
- Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
- Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
- Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
- Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).
- Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
- Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
- Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).
- LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , (2005).
- Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
- White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
- Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
- Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
- Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
- Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
- Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
- Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
- Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).
