淋菌ATP の使用率が集計を使用して商業試金およびライブ/デッド染色の抗生物質感受性の定量的検討
Summary
単純な ATP 測定法およびライブ/デッド染色法は、定量化し、セフトリアキソン、治療後の淋菌生存を視覚化する使用されました。このプロトコルを拡張して任意の抗生物質の抗菌効果を確認して、細菌バイオ フィルムにおける抗生物質の最小発育阻止濃度を定義する使用ことができます。
Abstract
抗生物質耐性淋菌(GC) の出現は、世界的な健康の脅威であるし、治療に失敗する人を識別する必要性を強調します。このグラム陰性細菌は、ヒトの排他的淋疾を引き起こします。感染、時にバイオ フィルムおよび/または集合体を形成することです。最小発育阻止濃度 (MIC) テストは、適切な治療の定義、抗生物質に対する感受性を決定するために使用されます。しかし、生体内での撲滅と検査結果の関係のメカニズムは知られていません。GC 集計の抗生物質感受性に影響を与えるし、骨材粒径と抗生物質感受性との関係を示していますどのように調べ方法が開発されました。GC 集計、彼らは抗生物質の殺害に抵抗力があるが、中心部の細菌の存続セフトリアキソン治療よりも周囲の。データを示す淋菌集計が標準寒天培地プレート ベース マイク メソッドを使用して反映されていないセフトリアキソンに感受性を減らすことができます。本研究で用いられた方法は臨床的に関連する条件の下で細菌の感受性をテストする研究者になります。
Introduction
淋病は、性感の一般的な感染症 (STI)1です。淋菌(GC)、グラム陰性菌 diplococcal 菌がこの病気の原因となるエージェントです。性器の感染症の症状は尿道分泌物、全身性器の痛み、排尿時の痛みになります。感染はしばしば無症候性2,の3,の4、5であり拡張植民地化できます。これらの未処理の伝染は、有機物の伝達を容易にする可能性がある、これは骨盤の炎症性病気 (PID) などの合併症につながることができ、播種性淋菌感染症 (DGI)6に主要な健康の心配。抗生物質耐性の淋病は主要な公衆衛生の危機および増加の社会経済的負担7 です。セファロスポリンに感受性の低下は、単一抗生物質から8セフトリアキソンとアジスロマイシンまたはドキシサイクリンを組み合わせたデュアル療法への治療レジメン変更になりました。セフトリアキソンとアジスロマイシン9,10, 無症候性感染症との組み合わせでの増加の障害は、淋病の治療の失敗を理解する必要性を強調表示します。
寒天培地希釈法とディスク拡散テストを含む、最小発育阻止濃度 (MIC) テストは、抗生物質への抵抗を識別する標準的な検査として使用されています。それにもかかわらず、マイクのテストは、生体内で細菌の抗生物質耐性を反映している場合は明らかです。抗生物質の殺菌濃度の存在下で細菌の生存に貢献する細菌バイオ フィルムの形成: マイクのテストはこの効果11を検出することができるではないです。我々 はその抗生物質仮説 GC は、粘膜の表面12バイオ フィルムを形作ることができる、ため凝集感受性は個人総合順位で見られると異なるでしょう。さらに、研究の 3 段階可変表面分子、Pili、不透明度関連タンパク質 (Opa)、異なった大きさで分類された骨材13,につながる細菌間の相互作用を調節する、lipooligosaccharides (ロサンゼルス)、示されています。14,15します。 適切な方法の不足のため抗生の抵抗をこれらのコンポーネントの貢献は検査されなかった。
現在、バイオ フィルム撲滅を測定するいくつかの方法があります。最も広く使用されている定量法は、クリスタル バイオレット染色16を用いたバイオマスの変化を測定することによってです。ただし、メソッドには、実験繰り返し17のエラー メッセージを生成することができます潜在的重要な実験操作が必要です。ここで使用されるライブ/デッド染色法では、ライブとデッドの細菌とバイオ フィルム内の分布の可視化ことができます。しかし、バイオ フィルムの構造は、染料の浸透を軽減する物理的な障壁として提起できます。したがって、グループ内でのライブ/デッド細菌を定量化する染色するは、小さなバイオ フィルムまたはその前駆体 microcolonies または集計に限定されます。寒天培地希釈法とディスク拡散テストを含む他の方法は、凝集の効果を測定することは。必要両方が測定できる定量細菌を生きていると、その分布を可視化する理想的な方法抗菌薬曝露後の集計内で GC の感受性を調べる。
ここで説明する手順を組み合わせた ATP 使用率測定して GC 感受性抗生物質の存在下で凝集を目視で調べてライブ/死んで染色定量的に分析します。
Protocol
Representative Results
Discussion
細菌は、人間の体の感染時にバイオ フィルムを形成できます。従来のマイクのテストでは、バイオ フィルム中の細菌を根絶するために必要な濃度を表さない場合があります。バイオ フィルムに抗菌薬の効果をテストするため CFUs のめっきと同様にバイオ フィルムのバイオマスに基づくメソッドがバイオ フィルムの構造の影響により誤ったことができます。たとえば、めっき法は、バイオ ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、D.C.S. と W.S. AI123340 に国立衛生研究所からの助成金によって支えられました。J.W.、l. c. w. a. c.、e. n. がパーツ/メリーランド大学によって資金を供給された「初年度イノベーション & 研究体験」プログラムに参加でサポートされていたとします。資金提供者を発行し、研究デザイン、データ収集、分析、決定または原稿の準備で役割がなかった。我々 はすべての顕微鏡実験のため UMD CBMG イメージング コアを認めます。
Materials
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
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