Summary
Det primære mål med denne artikel er at give oplysninger om, hvordan man registrerer membran potentiale (Vm) fra den midterste cerebrale arterien ved hjælp af mikroelektrode Spidning på pæl metode. Den kanylerede midterste cerebrale arterier er ækvilibreret for at få myogenic tone, og beholderen væg er spiddet ved hjælp af høj modstand mikroelektroder.
Abstract
Membran potentialet (Vm) af vaskulære glatte muskelceller afgør fartøjets tone og dermed blodtilførslen til et organ. Ændringer i ekspression og funktion af ionkanaler og elektro gene pumper, der regulerer Vm i sygdomstilstande, kan potentielt ændre vm, vaskulær tone og blodgennemstrømning. Således er en grundlæggende forståelse af Elektrofysiologi og de nødvendige metoder til nøjagtigt at registrere Vm i sunde og syge stater afgørende. Denne metode vil tillade modulere Vm ved hjælp af forskellige farmakologiske midler til at genoprette vm. Selv om der er flere metoder, hver med sine fordele og ulemper, denne artikel indeholder protokoller til at optage Vm fra kanylerede modstand fartøjer som den midterste cerebral arterien ved hjælp af mikroelektrode Spidning på pæl metode. Midterste cerebrale arterier har lov til at få myogenic tone i en myograph kammer, og beholderen væggen er spiddet ved hjælp af høj modstand mikroelektroder. Vm -signalet opsamles gennem en elektromagnet, digitaliseret og analyseret. Denne metode giver en nøjagtig aflæsning af Vm på en fartøjs væg uden at beskadige cellerne og uden at ændre membran modstanden.
Introduction
Membran potentialet (Vm) i en celle refererer til den relative forskel mellem ionisk ladning på tværs af plasma membranen og membranens relative permeabilitet over for disse ioner. Vm genereres af differentialfordelingen af ioner og vedligeholdes af ionkanaler og pumper. Ionkanaler som K+, na+og CL− bidrager væsentligt til hvile Vm. Vaskulære glatte muskelceller (Vsmc'er) udtrykker mere end fire forskellige typer af K+ kanaler1, to typer af spænding-gated ca2 + kanaler (vgcc)2, mere end to typer af CL− kanaler3, 4 af , 5, lager drevne ca2 + kanaler6, stretch-aktiverede kation kanaler7,8, og elektro gene natrium-kalium ATPase pumper9 i deres plasma membraner, som alle kan være involveret i reguleringen af Vm.
Vm af Vsmc'er afhænger af lumen tryk. I ikke-trykbærende beholdere varierer Vm fra-50 til-65 mv, men i trykbærende arterielle segmenter spænder vm fra-37 til-47 mv10. Elevation af Intravaskulært tryk forårsager vsmc'er til depolarisere11, nedsætter tærsklen for vgcc åbning, og øger calcium tilstrømning bidrager til udviklingen af myogenic tone12. Tværtimod vil membran hyperpolarisering, på grund af høj K+ kanal aktivitet, i passive eller ikke-trykbeholdere forhindre vgcc i at åbne, hvilket resulterer i begrænset calcium indgang og et fald i intracellulær calcium, hvilket bidrager til mindre vaskulære tone13. Således, Vm på grund af ændringer i lumen tryk synes at spille en væsentlig rolle i vaskulær tone udvikling, og både Vgcc og K+ kanaler spiller en afgørende rolle i reguleringen af Vm.
Vm varierer mellem fartøjstype og art. Vm er-54 ± 1,3 mv i marsvin Superior mesenterisk arteriel strimler14,-45 ± 1 mv i rotte midterste cerebrale arterier ved 60 mmHg lumen Tryk12, og-35 ± 1 mv i rotte parenchymalarterier ved 40 mmHg lumen Tryk15. Hvile Vm indspillet i ustrakt rotte lymfe muskulatur er-48 ± 2 mv16. Vm af cerebrale Vsmc'er er mere negativ end i perifere arterier. I sammenligning, Feline midterste cerebral arterier blev rapporteret at have en Vm af ca-70 mv, mens mesenteriske og koronararterier blev rapporteret at have-49 og-58 mv, henholdsvis17,18. Forskelle i Vm på tværs af vaskulære senge kan afspejle forskellene i ekspression og funktion af ionkanaler og elektro gene natrium-kalium pumper.
Stigninger og fald i Vm kaldes henholdsvis membran depolarisering og hyperpolarisering. Disse ændringer i Vm spiller en central rolle i mange fysiologiske processer, herunder ion-kanal gating, celle signalering, muskelsammentrækning, og handling potentiel formering. Ved et fast tryk, mange endogene og syntetiske vasodilatator forbindelser, der aktiverer K+ kanaler forårsage membran hyperpolarisering, resulterer i vasodilatation1,13. Omvendt, vedvarende membran depolarisering er afgørende i agonist-induceret eller Receptor-medieret vasokonstriktion19. Vm er en kritisk variabel, der ikke kun regulererca 2 + tilstrømning gennem vgcc13 , men også påvirker frigivelsen afca 2 + fra interne butikker20,21 og ca2 +-følsomhed af kontraktile apparatet22.
Mens der er flere metoder til at registrere Vm fra forskellige celletyper, synes data indsamlet fra mikroelektrode Spidning på pæl metode af kanyler, der er mere fysiologiske end data indhentet fra isolerede vsmc'er. Ved optagelse fra isolerede VSMC ved hjælp af aktuelle klemme metoder, ses Vm som spontane forbigående hyperpolariseringer i VSMCs24. Isolerede Vsmc'er er ikke i syncytium, og ændringerne i serie modstanden kan bidrage til oscillatoriske opførsel af Vm. På den anden side, oscillerende adfærd er ikke observeret, når Vm er indspillet fra intakte fartøjer, sandsynligvis på grund af celle celle kontakt mellem vsmc'er, der er i syncytium i arterien og er summeret i hele beholderen fører til en stabil Vm 24. målingen af Vm fra trykbeholdere, der anvender standard mikroelektrode teknik, er således relativt tæt på de fysiologiske forhold.
Optagelse vm fra kanyler kan give vitale oplysninger, da vm af vsmc'er, der er i syncytium er en af de vigtigste determinanter for vaskulær tone og blodgennemstrømning, og graduering af vm kunne give en måde at spile eller konstrikte blodkar. Derfor er det vigtigt at forstå den metode, der er involveret i optagelse Vm. Denne artikel beskriver intracellulær optagelse af Vm fra kanylerede midterste cerebrale arterier (mub) ved hjælp af en mikroelektrode Spidning på pæl metode. Denne protokol vil beskrive, hvordan de monetære udligningsbeløb, mikroelektroder, der er oprettet elektrometer og udføre den Spidning på pæl metode til at optage Vm. Der diskuteres også repræsentative data, almindelige problemer, der opstod under brugen af denne metode og potentielle problemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hanrotter blev opstaldet i dyrepleje anlægget i UMMC, som er godkendt af foreningen til vurdering og akkreditering af laboratorie dyrepleje (AAALAC). Dyrene havde fri adgang til mad og vand under hele studiet. Dyrene blev holdt i et kontrolleret miljø med en temperatur på 24 ± 2 °C, fugtighedsniveauer på 60 – 80% og 12 h lys/mørke cyklusser. Alle protokoller blev godkendt af Udvalget for dyrepasning og-brug i UMMC.
1. klargøring af udstyr
- Anbring en dobbelt kanal differentialelektrometer forstærker (Se materiale oversigten) tæt på fartøjets kammer og på den ønskede placering.
- Tilslut outputtet fra forstærker kanalen A eller B til digitizer's kanalindgang med et BNC-BNC-kabel.
- Sæt sonden i mikroskop-og mikrolympen, og anbring den i nærheden af mikroskopet og myografen. Optagelses opsætningen skal være installeret på et vibrationsfrit bord.
- Anbring knapperne og kontakterne på forsiden af forstærkeren i positioner, der konfigurerer den til dette eksperiment som beskrevet i manualen.
- Forbind badet jorden til forstærkerens kredsløb ved hjælp af en passende elektrode. Tilsvarende sikre, at buret er jordet til chassiset af forstærkeren.
2. klargøring af Mikroelektroder og montage
-
Brug borosilicat glas mikroelektroder (se tabel over materialer) og træk glas spidsen til at have en 8-10 mm taper, diameter på < 1 μm og modstand på 80 – 120 MΩ, når den fyldes med 3 M KCl.
- Brug en standard aftrækker til at opnå en kort gradvis taper ved hjælp af følgende indstillinger: varme = 650; hastighed = 20; pull = 25; tid = 250 og loop to gange for højere resistans og mindre tips. Se tabellen over materialer , da indstillingerne er instrumentspecifikke.
Bemærk: Spids diametre < 1 μm vil forårsage minimal beskadigelse af cellen, når den bliver spiddet.
- Brug en standard aftrækker til at opnå en kort gradvis taper ved hjælp af følgende indstillinger: varme = 650; hastighed = 20; pull = 25; tid = 250 og loop to gange for højere resistans og mindre tips. Se tabellen over materialer , da indstillingerne er instrumentspecifikke.
-
Fyld mikroelektroden med 3 M KCl ved hjælp af en mikrofibersprøjte (se tabellen over materialer).
- Træk langsomt i mikrofibersprøjtens stempel, mens du injicerer 3 M KCl i mikroelektroden for at give plads til, at væsken kan fyldes, og for at forhindre dannelsen af luftbobler inde i mikroelektroden.
- Fyld mikroelektroden, indtil den er fuld, og sørg for, at der ikke er luftbobler, før den anbringes i mikroelektrode holderen. Hvis der er bobler til stede, skal du forsigtigt tappe på mikroelektroden med en finger for at fjerne boblerne.
- Ved at udvise forsigtighed skal elektrode skaftet skubbes ind i holderen gennem hullet. Hvis overskydende væske er til stede, skal du fjerne det med et væv.
- Tilslut Elektrodeholderen til forstærker sonden. Udfør en elektrode test, Juster indgangs forskydningen, Bekræft nulindstilling og kontrollér udsivningen af sonden i henhold til forstærker manualen.
- Mål elektrode modstanden ved hjælp af en elektrode test som vist i tabel 1.
- Bemærk, at en fungerende elektrode viser et positivt DC-spændings skift på 1 mV/MΩ ved kanal udgangen. På den anden side, hvis en stor spænding vises på kanalen output og på måleren, dette indikerer en blokeret eller brudt elektrode.
- Åbn optagelses softwaren, Tildel et navn til filen, og Gem den til fremtidig analyse i en lagrings software.
3. isolation og Kanylering af den midterste cerebrale arterie
-
Klargøring af reagenserne.
- Forbered normal og lav calcium fysiologisk saltopløsning (PSS) som beskrevet i tabel 2.
-
Forbered myografen.
- Skyl myograf kammeret (Se tabellen over materialer) med destilleret vand flere gange for at holde det fri for snavs. Læg kammeret med 5 mL af det normale PSS.
- Fyld begge glas kanyler med filtreret normal PSS ved hjælp af en 5 – 10 mL sprøjte. Fyld forsigtigt hele kanylen og den vedlagte slange uden at indføre luftbobler.
- Forbered to monofilamenter nylon suturer (10-0, 0,02 mm) med en halv-knude hver med stump pincet.
- Anbring de delvist lukkede sutur knuder på begge kanyler lidt væk fra spidsen ved hjælp af dissektions pincet under et dissektion-mikroskop. Senere vil disse knuder blive gledet af og bundet forsigtigt på de kanyler, der er i en kanyle, for at sikre fartøjet.
-
Isoler og kanyle den midterste cerebral arterie.
- Fremkald dyb anæstesi i en Sprague Dawley rotte ved at bruge 2 – 4% inhaleret isofluran.
- Dekapiterer rotten ved hjælp af guillotine under dyb anæstesi.
- Fjern forsigtigt kraniet med en knogle skærer og en saks.
- Fjern hjernen fra kraniet og anbring den i 5 mL lavt calcium PSS på is.
- Identificer og dissekere et uforgrenet segment af rotte midterste cerebral arterie (MCA) med en indre diameter på 100 – 200 μm fra hjernen ved hjælp af fjeder saks og pincet.
- MCA monteres på glas kanyler ved hjælp af fine pincetter og fastspændes ved at stramme suturerne i myografen, der indeholder det normale PSS.
- Luk den distale kanyle, så der ikke kommer noget flow inden for de monetære udligningsbeløb.
- Tilslut indinflow-pipetten til et reservoir, der holder PSS, for at give mulighed for kontrol af intraluminaltryk, som vil blive overvåget med en in-line tryk transducer.
- Visualiser de kanonerede monetære udligningsbeløb ved hjælp af et oplader koblet enheds kamera (Se tabellen over materialer), der er monteret på et inverteret mikroskop og et billedbehandlingsprogram.
- Indstil den aksiale længde af MCA til en omtrentlig længde, hvor den skal fremstå hverken stiv eller slap.
- Ækvilibrere bade opløsningen med O2 (95%) og CO2 (5%) ved 37 °C for at sikre tilstrækkelig iltning, temperatur og opretholdelse af pH ved 7,4.
-
Impale (trænge ind i celle plasma membranen) de vaskulære glatte muskelceller.
- Forbind jord elektroden og hold den nedsænket i myografens PSS.
- Oplys fartøjets kammer og kig gennem mikroskopet for at visualisere spidsen af mikroelektroden i badet opløsning.
Bemærk: Alternativt kan man visualisere MCA og mikroelektroden på en computer, der har en billedbehandling software. - Brug knapperne på micromanipulatoren til at flytte spidsen af mikroelektroden tæt på blodkar Rens ydre væg. Micromanipulatoren og spidsen af mikroelektroden skal befinde sig i en stabil position i forhold til vævet.
Bemærk: Før forsøgene påbegyndes, skal det bekræftes, at membran spændingen er stabiliseret. Hvis den målte spænding er ustabil, er forbindelsen mellem elektroden og cellen ikke forseglet, hvilket indikerer en lækage. - Begynd optagelsen.
- Bevæg langsomt spidsen af mikroelektroden mod fartøjet, der sigter mod midten af fartøjet ved hjælp af kurs eller fin kontrol af micromanipulator.
Bemærk: Lejlighedsvis, en lille afbøjning i optagelsen kan observeres, når mikroelektrode spidsen kontakter en muskel fiber membran. - Når spidsen kommer i umiddelbar nærhed af beholderen, skal du fremrykke elektroden fremad i en hurtig bevægelse ved hjælp af micromanipulatoren for at spidde musklens membran.
- På dette tidspunkt kan man begynde at observere ændringer i Vm bliver indspillet. Rør ikke ved micromanipulatoren, når mikroelektroden impalerer cellens membran.
Bemærk: Forskellen i spænding mellem optagelses-og reference elektroden falder fra 0 mV til mellem-40 mV og-75 mV afhængigt af niveauet af Intravaskulært tryk eller andre excitatoriske eller hæmmende stimuli. Disse målinger karakteriserer den transmembran potentielle forskel i den aktuelle celle. - Udfør flere indsættelser på et enkelt fartøj i forskellige områder af fartøjet uden at beskadige Vsmc'er for at få nøjagtige målinger.
- Efter optagelsen skal du bruge manipulatoren til at fjerne mikroelektroden i én hurtig bevægelse.
- Stop optagelsen og Gem datafiler til yderligere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den præsenterede metode kan pålideligt bruges til at optage Vm i kanyler. En kort procedure, der beskriver, hvordan man isolerer MCA fra hjernen, er præsenteret i figur 1a. Efter at have adskilt hjernen fra kraniet blev MCA dissekeret og anbragt i en Petri skål med lavt calcium-PSS. En del af bindevæv, der var vedhæftet blev også dissekeret sammen med MCA ved hjælp af fjeder saks og pincet for at forhindre skader på MCA under isolation. Omhyggeligt, bindevæv blev også fjernet, og det dissekterede MCA var klar til at overføre til myograph. MCA blev monteret på kanyler og bundet ved hjælp af sutur knob på begge ender af kanyler i myografen. En skematisk gengivelse af en typisk mikroelektrode-metode opsætning er vist i figur 1b. En mikroelektrode fyldt med 3 M KCl var forbundet med elektrometer via en holder i sonden. Elektrometerets kanal udgang blev tilsluttet en analog indgangskanal til en digitizer ved hjælp af et BNC-BNC-kabel. Digitizer output blev yderligere forbundet til en oscilloskop at visualisere signalet i optagelsen software. Jorden er etableret ved hjælp af en AgCl pellet wire, der blev forlænget fra chassiset af elektrometer til badet opløsning i myografen. Endelig blev der visualiseret digitale spor i indspilnings softwaren på computerskærmen.
MCA blev derefter inkueret i frisk tilberedt varmt PSS og blev presset til 60 mmHg. Kun fartøjer, der får tone blev brugt til Vm optagelse. Efter at fartøjet fik en betydelig tone, blev mikroelektroden fremrykket ind i fartøjets væg. Arteriel diameter og Spidning på pæl af arterien blev visualiseret ved hjælp af video mikroskopi. Impalement anses for vellykket, når der er en hurtig afbøjning til negative værdier, Vm er stabil i ≥ 30 s, og spændingen vender brat til 0 mv ved fjernelse af elektroden som vist i figur 212,15. Vores resultater tyder på, at i en MCA, der er under tryk til 60 mmHg, Vm er ~-43,2 ± 2,9 mv.
Efter en vellykket Spidning på pæl og vm stabilisering, de lægemidler, der ændrer vm blev perfektebrugt i badet og ændringer i vm blev indspillet. Vi brugte 20 mm KCl til depolarisere og 20 μM NS1619, en syntetisk stor konduktans kaliumkanalåbner, til hyperpolarize membranen. Vores resultater tyder på, at perfusion af kammeret med KCl depolariserede membranen med ~ 5,8 ± 0,18 mV. På den anden side, perfusion med NS1619 hyperpolariseret membranen af ~ 3,8 ± 0,4 mV.
Figur 1: en illustration af isolation af midterste cerebrale arterier og registrering af membran potentiale ved hjælp af mikroelektrode Spidning på pæl metode. (A) ved hjælp af fjeder saks skæres hjernen eller bindevæv langs de stiplede linjer. Overfør og monter MCA mellem de to glas kanyler, og fastgør den ved hjælp af suturer i myograph-kammeret, der er fyldt med PSS. (B) en mikroelektrode fyldt med 3 M KCl indsættes i holderen og tilsluttes til sonden. Ændringer i transmembran potentiel rejse fra sonden til en elektromagnet og til digitizer via et BNC-kabel (BNC kabel er forbundet fra kanal output af elektrometer og til en analog indgang af en Digitizer). Det digitaliserede potentiale ses i indspilnings softwaren på monitoren. Jorden er etableret ved hjælp af en AgCl pellet wire forbundet fra elektrometer til badet opløsning i myografen. MCA = midterste cerebral arterie; PSS = fysiologisk saltopløsning; AgCl = sølvchlorid. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: optagelse af membran potentiale ved hjælp af mikroelektrode Spidning på pæl metode fra kanylerede midterste cerebrale arterier. Repræsentativ spor af Vm. Impalement anses for vellykket, hvis der er en brat afbøjning til negative værdier ved elektrode indtastning, Vm er stabil i ≥ 30 s, og spændingen vender brat til 0 mv ved fjernelse af elektroden. X-aksen repræsenterer klokkeslættet, og Y-aksen repræsenterer membran potentialet. Den stiplede linje repræsenterer den justerede baseline før udstrækningen af fartøjet. SEK = sekunder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: registrering af ændringer i membran potentialet ved hjælp af mikroelektrode udstråle metode, når beholderne udsættes for vasoaktive stoffer. Vm blev indspillet ved hjælp af mikroelektrode Spidning på pæl metode fra kanylerede midterste cerebrale arterier før og efter eksponering for vasoaktive agenter. Prøve spor repræsenterer (a) depolarisering som respons på 20 mm KCl og (B) hyperpolarisering som respons på 20 μM NS1619 — en stor konduktans kalium kanal agonist. (C) oversigts bjælkediagram over ændringerne i Vm før og efter påføring af KCl og NS1619. Den stiplede linje repræsenterer hvile Vm. Tallet i parentesen angiver det antal fartøjer, der er anvendt i undersøgelsen. Bemærk, at Vm nået baseline, så snart stoffet er skyllet ud. Fejl linjen repræsenterer standardfejlen for middelværdien. SEK = sekunder. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Indstillinger af elektrometer til måling af elektrode resistens | |
| Måler indgang | Kanal A eller B |
| Skift mellem position | I |
| Måler rækkevidde | Skift til 200 mV |
| Elektrode | I badet |
| Tilstand | Drift til elektrode test |
| Måler indikation | 1 mV/MΩ |
Tabel 1: indstillinger af elektrometer til måling af elektrode modstand.
| Kemikalier | lavt calcium PSS mM | Normalt PSS mM | Virksomhed | Katalog | |
| 1 | Nacl | 119,00 af | 119,00 af | Sigma | S7653 |
| 2 | KCl | 4,70 af | 4,70 af | Sigma | P4504 |
| 3 | MgSO4 | 1,17 af | 1,17 af | Sigma | M7506 |
| 4 | CaCl2 | 0,05 af | 1,60 af | Sigma | C3881 |
| 5 | HEPES | 5,00 af | 5,00 af | Sigma | H7006 |
| 6 | Glukose | 10,00 af | 10,00 af | Sigma | G7021 |
| 7 | NaH2po4 | 1,18 af | 1,18 af | Sigma | S0751 |
| 8 | Af NaHCO3 | 18,00 af | 18,00 af | Sigma | S5761 |
| pH: 7,4 | pH: 7,4 |
Tabel 2: reagenser, der anvendes til fremstilling af lav calcium og normal fysiologisk saltopløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel indeholder de nødvendige trin til, hvordan man bruger en skarp mikroelektrode-Spidning på pæl metode til at optage Vm fra en kanylerede beholder. Denne metode er almindeligt anvendt, og tilbyder høj kvalitet, konsistente optagelser af Vm , der besvarer en bred vifte af eksperimentelle spørgsmål.
Nogle kritiske overvejelser og fejlfindingstrin beskrives her for at sikre, at metoden lykkes. Kvaliteten af mikroelektroden (skarpheden og modstanden) og den cellulære proces, den trænger ind i, påvirker stabiliteten og nøjagtigheden af Vm. Hvis signalet konstant driver eller er over eller under forstærkeren optagelses område, er det mest sandsynligt, at elektroden er blokeret, eller spidsen er brudt. Hvis indskuddet kun er delvist, utilstrækkeligt eller beskadiger cellen, stiger det registrerede potentiale tilbage til 0 mV, hvilket resulterer i et ustabilt signal eller intet signal. I nogle tilfælde kan cellens indhold også blokere for den meget høje modstands elektrode. Alle disse problemer kan løses ved blot at udskifte elektroden med en ny.
For vellykket impalement, skal man sikre, at den totale modstand af cellemembranen er uændret, og den målte membran potentiale er stabil uden lækager mellem elektroden og membranen. Det er afgørende, at elektroden er fremskreden mod cellen af en stabil micromanipulator. Når avanceret til inden for et par mikrometer af cellen, spidsen potentiale vil ændre resulterer i en lille deformation i den detekterede spænding. For at undgå at beskadige spidsen af elektroden eller strække cellemembranen, er hurtig fremføring af elektroden nødvendig. Vellykket Spidning på pæl er karakteriseret ved en hurtig dråbe i membran potentiale efterfulgt af en stabilisering omkring hvile potentialet i membranen. Hvis den potentielle aflæsning svinger, er det muligt, at spidsen af elektroden har forstyrret membranen, der forårsager natrium til at lække ind i cellen og kalium til at sive ud af cellen, hvilket resulterer i progressiv depolarisering. Et andet problem i denne metode er, at knude potentialer og elektrode spids potentialer kan tilføje en unødvendig artefakt til Vm optagelsen. Junction potentialer opstår, når forskellige ledere kommer i kontakt. Der er to forskellige typer af forgrenings potentialer, flydende metal og væske-væske. Der dannes væske-metal-kryds, når spidsen af sonden kontakter elektrolyt i mikropipetten. Væske-væske-kryds, også kaldet flydende samlings potentiale, opstår, når to opløsninger af varierende koncentrationer kommer i kontakt. Udbredelsen af ioner mellem løsningerne bidrager til udviklingen af potentialet. Desuden kan egenskaberne for glaselektrode spidsen interagere med væske generere spids potentialer. For at minimere krydset samt spids potentialer, kan nulstilling af det målte potentiale i badet reducere den uønskede bias. Under impalement, man kan ikke udelukke muligheden for, at Endothelial, snarere end glatte muskler, Vm kunne uforvarende blive udtaget i nogle eksperimenter. Men, undersøgelser tyder på, at endotelet og VSMC lag er elektrisk koblet i små arterioler og udviser lignende Vm svar23.
I sidste ende er tre trin i denne proces afgørende for at opnå vellykkede optagelser. For det første skal fartøjerne forberedes korrekt, så det sikres, at de ikke beskadiges i processen. For det andet skal mikroelektroder trækkes til de rigtige elektriske egenskaber. Endelig er hurtig Spidning på pæl af membranen uden at bryde spidsen er afgørende for præcise resultater. Investigator skal forstå Elektrofysiologi, hvordan man skaber levedygtige mikroelektroder, og hvordan man opsætter og bruger en elektrometer.
På trods af sin betydning, denne metode har forskellige begrænsninger. Første, de samlede omkostninger til at anskaffe alt udstyr er høj (~ $30-40000). For det andet er der behov for nye fartøjer til alle disse eksperimenter. derfor et dyr er aflives for hvert forsøg, hvilket øger de samlede omkostninger. Tredje, dissektion af cerebrale arterier, kanyler af skibene er kedelig, dyrt og har en indlæringskurve. For det fjerde, forbereder mikroelektroder, impalement, og optagelse Vm kræver en grundig forståelse af Elektrofysiologi. Endelig, at etablere denne oprettet i laboratoriet kræver dedikeret personale, tid og kræfter.
Vm er en essentiel elektrofysiologisk egenskab, der bestemmer den vaskulære tone og dermed blodtilførslen til et organ. Vm kan ændres af flere vasoaktive kemikalier, der frigives fra neuroner, endotelet og blodkomponenter. Mens vasokonstriktorer depolariserer membranen, dilatorer hyperpolarize membranen. Flere proteiner, herunder K+ kanaler, vgcc, natrium kalium ATPase, ca2 + ATPase, CL- kanaler, store-opererede og stretch kanaler regulere Vm. Ændringer i nogen af disse proteiner i sygdomstilstande kan potentielt ændre Vm og dermed vaskulær tone og blodgennemstrømning. Mikroelektrode Spidning på pæl metoden er nyttig til at registrere hvile samt ændringer i Vm som reaktion på vasokonstriktorer og dilatorer. Så denne metode kan bruges pålideligt til at forstå normale og ændrede Vm forbundet med sygdom, og kan være nyttige i udviklingen af farmakologiske midler designet til at Moduere vm, vaskulær tone og blodgennemstrømning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra Intramural support Research program (IRSP) fra UMMC, AHA videnskabsmand udviklings legat (13SDG14000006) tildelt Mallikarjuna R. Pabbidi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments | |||
| Aneshetic Vaporiser | Parkland scientific | V3000PK | |
| Dissection microscope | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
| Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
| Littauer Bone Cutter | Fine science tools | 16152-15 | |
| Moria MC40 Ultra Fine Forceps | Fine science tools | 11370-40 | |
| Surgical scissors Sharp-Blunt | Fine science tools | 14008-14 | |
| Suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 15018-10 | |
| Electrophysiology Instruments | |||
| Charge-coupled device camera | Qimaging, , BC | Retiga 2000R | |
| Differential electrometer amplifier | WPI | FD223A | |
| In-line pressure transducer | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
| Micromanipulator | Thor labs | PCS-5400 | |
| Microelectrodes | Warner Instruments LLC, CT | G200-6, | |
| Micro Fil (Microfiber syringe) | WPI | MF28G67-5 | |
| Microelectrode holder | WPI | MEH1SF | |
| Myograph | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
| Puller | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
| Vibration-free table | TMC | 3435-14 | |
| Softwares | |||
| Clampex 10 | Molecular devices | ||
| p Clamp 10 | Molecular devices | ||
| Imaging software | Nikon, NY | NIS-elements | |
| Chemicals | |||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
References
- Nelson, M. T., Quayle, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).
- Hughes, A. D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. Journal of Vascular Research. 32 (6), 353-370 (1995).
- Large, W. A., Wang, Q. Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle. American Journal of Physiology. 271 (2 Pt 1), C435-C454 (1996).
- Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. Journal of Physiology. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
- Yamazaki, J., et al. Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells. Journal of Physiology. 507 (Pt 3), 729-736 (1998).
- Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone. Trends in Pharmacol Sciences. 19 (7), 266-269 (1998).
- Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 262 (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).
- Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig. Journal of Physiology. 501 (Pt 2), 343-353 (1997).
- Shelly, D. A., et al. Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), C813-C820 (2004).
- Coca, A., Garay, R. Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. , Taylor & Francis. (1993).
- Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circulation Research. 55 (2), 197-202 (1984).
- Knot, H. J., Nelson, M. T. Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure. Journal of Physiology. 508 (Pt 1), 199-209 (1998).
- Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone. American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).
- Harder, D. R., Sperelakis, N. Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium. American Journal of Physiology. 237 (1), C75-C80 (1979).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch. Lymphatic Research and Biology. 12 (2), 66-75 (2014).
- Harder, D. R. Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat. American Journal of Physiology. 239 (1), C23-C26 (1980).
- Harder, D. R. Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds. Federation Proceedings. 42 (2), 253-256 (1983).
- Cogolludo, A., et al. Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization. Circulation Research. 98 (7), 931-938 (2006).
- Ganitkevich, V., Isenberg, G. Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes. Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).
- Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 346 (6), 691-700 (1992).
- Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 347 (4), 438-444 (1993).
- Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro. American Journal of Physiology. 269 (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).
- Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T.
