Coltivazione di microalghe verdi in bolla colonna fotobioreattori e un saggio di lipidi neutri
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per costruire su scala di laboratorio bolla colonna fotobioreattori e li usa per cultura microalghe. Esso fornisce inoltre un metodo per la determinazione del tasso di crescita della cultura e del contenuto di lipidi neutri.
Abstract
C’è notevole interesse per lo studio delle microalghe per applicazioni di ingegneria come la produzione di biocarburanti, prodotti di alto valore e per il trattamento dei rifiuti. Come la maggior parte nuovi sforzi di ricerca iniziano a scala di laboratorio, c’è la necessità di metodi economici per la coltura di microalghe in maniera riproducibile. Qui, comunichiamo un approccio efficace alla cultura microalghe in fotobioreattori su scala di laboratorio e per misurare la crescita e il contenuto di lipidi neutri di quello alghe. Anche per istruzioni su come impostare il sistema di fotobioreattore. Anche se gli organismi di esempio sono specie di clorella e Auxenochlorella, questo sistema può essere adattato per coltivare una vasta gamma di microalghe, tra cui co-colture di alghe con specie non-alghe. Colture di riserva prima sono coltivate in bottiglie per la produzione di inoculo per il sistema di fotobioreattore. Inoculo di alghe è concentrato e trasferito in fotobioreattori per la coltivazione in modalità batch. I campioni sono raccolti ogni giorno per le letture di densità ottica. Alla fine della cultura batch, le cellule vengono raccolte da centrifuga, lavata e liofilizzati per ottenere una concentrazione finale di peso a secco. La concentrazione finale di peso a secco viene utilizzata per creare una correlazione tra la densità ottica e la concentrazione di peso a secco. Un metodo modificato di Folch viene successivamente utilizzato per estrarre i lipidi totali dalla biomassa liofilizzata e l’estratto viene analizzato per il suo contenuto di lipidi neutri usando un’analisi di micropiastre. Questo saggio è stato pubblicato in precedenza ma passaggi protocollo sono stati inclusi qui per evidenziare i passaggi critici della procedura cui frequentemente si verificano errori. Il sistema di bioreattore descritto qui riempie una nicchia tra coltivazione semplice boccetta e bioreattori commerciale completamente controllato. Replica anche con solo 3-4 biologico per il trattamento, il nostro approccio alla coltura di alghe porta a strette deviazioni standard nelle analisi del lipido e di crescita.
Introduction
L’applicazione di microalghe in ingegneria e biotecnologia ha attirato grande interesse negli ultimi anni. Microalghe sono allo studio per l’utilizzo in acque reflue trattamento1,2,3,4, biocarburanti produzione5,6,7,8e la produzione di prodotti nutraceutici e altri prodotti di alto valore9,10. Le alghe sono anche essendo geneticamente modificate al prezzo maggiore nel tentativo di migliorare la propria forma per ingegneria specifiche applicazioni11,12. Di conseguenza, c’è grande interesse nella sperimentazione con organismi industrialmente rilevanti nelle impostazioni controllate. Lo scopo di questo metodo è di comunicare un approccio efficace alla microalghe cultura in un ambiente di laboratorio controllato e per misurare la crescita e il contenuto di lipidi neutri di quello alghe. Migliorando la crescita tariffe e contenuto di lipidi neutri di microalghe sono stati identificati come due principali strozzature verso la commercializzazione dei biocarburanti alghe13.
Una vasta gamma di approcci sono stati utilizzati per le alghe di cultura per scopi sperimentali. In generale, questi approcci possono essere suddivisi tra coltivazione all’aperto su larga scala e su scala ridotta coltivazione indoor. Coltivazione all’aperto in fotobioreattori e stagni aperti è appropriato per la sperimentazione volta a scalare i processi che hanno già dimostrati a scala di laboratorio (ad esempio, per testare scale-up di un nuovo ceppo di alta-lipidico delle alghe)14. Tuttavia, la coltivazione su piccola scala indoor è opportuno durante lo sviluppo di ceppi di alghe nuove o migliorate o effettuando esperimenti volti a comprendere meccanismi biologici. In questi ultimi casi, per prendere in giro i cambiamenti sottili nel comportamento biologico è necessaria un’elevata di controllo sperimentale. A tal fine, colture axeniche sono spesso necessari al fine di ridurre al minimo i fattori biotici complessi connessi con altri organismi (per esempio batteri, altre alghe) che inevitabilmente crescono in grandi impianti all’aperto. Anche quando lo studio di interazioni tra le alghe e altri organismi, abbiamo trovato che uso di condizioni sperimentali altamente controllato è disponibile quando si esaminano scambio molecolare tra organismi15,16,17.
All’interno della categoria di coltivazione su piccola scala coperta di alghe, una gamma di approcci sono stati utilizzati. Forse l’approccio più comune è far crescere alghe in matracci di Erlenmeyer su una tabella di shaker sotto una luce banca18,19. Scambio di ossigeno e CO2 avviene per diffusione passiva attraverso una spina di schiuma nella parte superiore del pallone. Alcuni ricercatori hanno migliorato questo set-up attraverso aerazione attiva delle boccette20. Un altro approccio è quello di coltivare alghe in bottiglie, mixate da ancoretta e aerazione attiva. Nonostante la loro semplicità, abbiamo trovato che l’uso di bottiglie e boccette spesso porta a risultati incoerenti tra repliche biologiche. Presumibilmente questo è dovuto gli effetti di posizione – diverse posizioni ricevono diverse quantità di luce, che riguardano anche le temperature interne del reattore. Rotazione giornaliera dei reattori in nuove posizioni può aiutare ma non risolve il problema perché alcune fasi di crescita delle alghe (per esempio, presto esponenziale) sono più sensibili agli effetti posizionali rispetto ad altri (ad es., fase di log).
Sul lato opposto dello spettro di sofisticazione tecnologica sono completamente controllati commerciale fotobioreattori. Questi sistemi continuamente monitorare e regolare le condizioni nel reattore per ottimizzare la crescita delle alghe. Hanno illuminazione programmabili, controllo della temperatura in tempo reale e controllo del pH. Purtroppo, sono costosi e in genere costano diverse migliaia di dollari al reattore. Più riviste scientifiche e ingegneristiche richiedono la replica biologica dei risultati, rendendo necessario l’acquisto di più bioreattori. Presentiamo qui un sistema di reattore bolla colonna che colma il divario tra la semplice (pallone) e sofisticato (completamente controllato bioreattore) si avvicina per la coltivazione delle alghe su scala di laboratorio. Bolla colonne utilizzare delle bollicine di gas per facilitare lo scambio di gas e mescolare il reattore. Questo approccio fornisce un certo grado di controllo sull’illuminazione e temperatura ma lo fa in un modo che è conveniente. Inoltre, abbiamo trovato questo sistema per produrre risultati altamente coerenti tra replicati biologici, riducendo il numero delle ripetizioni biologici necessari al fine di ottenere risultati statisticamente significativi rispetto all’approccio fiasco o bottiglia. Abbiamo anche utilizzato questo sistema per coltivare con successo miscele di alghe e batteri21. Oltre alla coltivazione delle alghe, descriviamo una procedura per misurare il contenuto di lipidi neutri nelle alghe coltivate. Il metodo di quest’ultimo è stato pubblicato altrove22, ma includiamo la procedura qui per fornire istruzioni dettagliate su come impiegare con successo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La considerazione più importante quando la coltura di alghe è la comprensione delle esigenze specifiche dell’organismo o del gruppo di organismi. Il sistema di coltivazione qui descritto può essere utilizzato per una vasta gamma di alghe ma gli specifici fattori abiotici (temperatura, media, pH, intensità luminosa, livello di CO2 , tasso di aerazione) della coltura di alghe devono essere adattati alle esigenze dell’organismo. Nota i parametri descritti qui sono stati utilizzati per la coltivazione di c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il supporto per questa ricerca è stato fornito dallo USDA National Institute of Food e agricoltura Hatch progetto ALA0HIGGINS e gli uffici di Università Auburn del Prevosto, il Vice Presidente per la ricerca e la Samuel Ginn College di ingegneria. Supporto è stato fornito anche da NSF concedere CBET-1438211.
Materials
| Supplies for airlift photobioreactor setup | |||
| 1 L Pyrex bottles | Corning | 16157-191 | For bottle reactors, humidifiers |
| 1/2" hose clamp | Home Depot | UC953A | or equivalent |
| 1/4" female luer to barb | Nordson biomedical | Nordson FTLL360-6005 | 1/4" ID, PP |
| 1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50' |
| 1/4" in O-rings | Grainger | 1REC5 | #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D. |
| 1/8" Female luer to barb | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
| 1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250' |
| 1/8" male spinning luer to barb | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
| 1/8" multiport barb | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8" multiport barb |
| 1/8" NPT to barb | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8" 200 series barb |
| 1/8" panel mount luer | Nordson biomedical | Nordson MLRLB230-6005 | 1/8", PP |
| 10 gallon fish tank | Walmart | 802262 | Can hold up to 8 bioreactors depending on layout |
| 100-1000 ccm flow meter | Dwyer | RMA-13-SSV | For bottle reactors |
| 2 ft fluorescent light bank | Agrobrite | FLT24 T5 | |
| 200-2500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-14-SSV | For air regulation upstream of humidifier |
| 250 mL Pyrex bottles | Corning | 16157-136 | For gas mixing after humidifier |
| 50-500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-12-SSV | For hybridization tube reactors |
| 5-50 ccm flow meter | Dwyer | RMA-151-SSV | For CO2 flow rate control |
| Air filters 0.2 µm | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack |
| Check valves | VWR | 89094-714 | |
| Corning lids for pyrex bottles | VWR | 89000-233 | 10 GL45 lids |
| Female luer endcap | Nordson biomedical | Nordson FTLLP-6005 | Female stable PP |
| Hybridization tubes | Corning | 32645-030 | 35×300 mm, pack of 2 |
| Light timer | Walmart | 556393626 | |
| Locknuts | Nordson biomedical | Nordson LNS-3 | 1/4", red nylon |
| Low profile magnetic stirrer | VWR | 10153-690 | Low profile magnetic stirrer |
| Male luer endcap | Nordson biomedical | Nordson LP4-6005 | Male plug PP |
| Spinning luer lock ring | Nordson biomedical | Nordson FSLLR-6005 | |
| Stir bars – long | VWR | 58949-040 | 38.1 mm, for bottle reactors |
| Stir bars – medium | VWR | 58949-034 | 25 mm, for hyridization tubes |
| Supplies and reagents for culturing algae | |||
| 0.2 µm filters | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling |
| 1 mL syringes | Air-tite | 89215-216 | For filtering spent media from daily culture sampling |
| 1.5 mL tubes | VWR | 87003-294 | Sterile (or equivalent) |
| 10 mL Serological pipettes | Greiner Bio-One | 82050-482 | Sterile (or equivalent) |
| 100 mm plates | VWR | 25384-342 | 100×15 mm stackable petri dishes, sterile |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-276 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 2 mL Serological pipette tips | Greiner Bio-One | 82051-584 | Sterile (or equivalent) |
| 2 mL tubes | VWR | 87003-298 | Sterile (or equivalent) |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-348 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 96 well microplate | Greiner Bio-One | 89089-578 | Polystyrene with lid, flat bottom |
| Inocculating loops | VWR | 80094-478 | Sterile (or equivalent) |
| Liquid carbon dioxide tank and regulator | Airgas | CD-50 | |
| Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay | |||
| 2 mL bead tubes | VWR | 10158-556 | Polypropylene tube w/ lid |
| 96 well microplates | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polypropylene, flat bottom |
| Bleach | Walmart | 550646751 | Only use regular bleach, not cleaning bleach |
| Chloroform | BDH | BDH1109-4LG | |
| Dimethyl sulfoxide | BDH | BDH1115-1LP | |
| Isopropyl alcohol | BDH | BDH1133-1LP | |
| Methanol | BDH | BDH20864.400 | |
| Nile red | VWR | TCN0659-5G | |
| Pasteur pipette tips | VWR | 14673-010 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286-500G | |
| Vegetable oil | Walmart | 9276383 | Any vegetable oil should work as long as it is fresh |
| Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) | Biospec products | 11079105z | |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | XS205DU | Capable of at least 4 decimal accuracy |
| Bead homogenizer | Omni | 19-040E | |
| Benchtop micro centrifuge | Thermo | Heraeus Fresco 21 with 24×2 | Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes |
| Dry block heater | VWR | 75838-282 | Including dry block for a microplate |
| Freeze dryer | Labconco | 7670520 | 2.5L freeze drying system |
| Large benchtop centrifuge | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Capable of reading absorbance and fluorescence |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 |
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