중립 지질에 대 한 녹색 미세 거품 열 Photobioreactors에 시험 재배
Summary
여기, 우리 실험실 규모 거품 열 photobioreactors를 생성 하 고 문화 microalgae를 그들을 사용 하 여 프로토콜을 제시. 그것은 또한 문화 성장 율 및 중립 지질 내용에 대 한 메서드를 제공합니다.
Abstract
Microalgae 바이오 연료, 고부가가치 제품의 생산 등 엔지니어링 응용 프로그램에 대 한 및 폐기물의 처리를 위해의 연구에 상당한 관심이 있다. 대부분 새로운 연구 노력 실험실 규모에서 시작, 재현 방식에서 microalgae 재배에 대 한 비용 효과적인 방법에 대 한 필요가 있다. 여기, 우리 교통 문화 microalgae 실험실 규모 photobioreactors, 그리고 그 조류의 성장 내용과 중립 지질을 측정 하는 효과적인 접근 한다. 지침은 photobioreactor 시스템을 설정 하는 방법에 포함 됩니다. 예제에서는 생물 클로렐라 와 Auxenochlorella의 종 있지만,이 시스템 미세, 비 조류 종의 조류의 공동 문화를 포함 한 넓은 범위를 육성 하기 위해 적응 수 있다. 재고 문화 처음 inoculum photobioreactor 시스템을 생산 하는 병에서 성장 된다. 조류 inoculum 집중 이며 일괄 처리 모드에서 재배에 대 한 photobioreactors로 전송 합니다. 샘플은 광학 밀도 판독을 매일 수집 됩니다. 배치 문화의 끝에, 셀, 원심 분리기에 의해 수확 하 고 동결 건조는 최종 건조 중량 농도를. 최종 건조 중량 농도 광학 밀도 건조 중량 농도 사이의 상관 관계를 생성 하는 데 사용 됩니다. 수정된 Folch 메서드는 이후에 동결된 바이오 매스에서 총 지질을 추출 하 고 추출 microplate 분석 결과 사용 하 여 중립 지질 내용 분석. 이 분석 결과 이전에 게시 되었습니다 하지만 프로토콜 단계 오류가 자주 발생 하는 절차의 중요 한 단계를 강조 하기 위해 여기 포함 됐다. 여기에 설명 된 생물 반응 기 시스템 간단한 플라스 크 및 상업 bioreactors 완벽 하 게 제어 사이의 틈새 시장을 채웁니다. 치료 당도 3-4 생물 복제, 우리의 접근 방식 조류 배양 성장 및 지질 분석 실험에 꽉 표준 편차를 리드.
Introduction
미세 공학 및 생명 공학에서의 응용 프로그램은 최근 몇 년 동안에 큰 관심을 모으고 있다. Microalgae 폐수 처리1,2,3,4, 바이오 연료 생산5,6,7,8, 사용을 위해 공부 되 고 있다 그리고 영양 보충 식품 및 다른 높은 가치 제품9,10의 생산. 조류는 또한 유전자 수정 중인 큰 속도로 특정 엔지니어링 응용 프로그램11,12에 대 한 그들의 적합성을 향상 하기 위해 따라서, 제어 설정에서 산업으로 관련 유기 체를 가진 실험에 큰 관심이입니다. 이 방법의 목적은 문화 미세 제어 실험실 환경에서 효과적인 접근을 의사 소통을 하 고 측정할 성장과 그 조류의 중립 지질 내용. 성장을 향상 속도 중립 지질 콘텐츠 미세 조류 바이오 연료13의 상용화를 향해 두 주요 병목 확인 되었습니다.
다양 한 접근 문화 조류 실험적인 목적을 위해 사용 되었습니다. 일반적으로 이러한 방법은 대규모 야외 재배 및 소규모 실내 재배 사이 나눌 수 있습니다. Photobioreactors와 오픈 연못에 야외 재배 실험 실험실 규모 (예를 들어, 조류의 새로운 하이-지질 긴장의 스케일-업 테스트)에서 이미 입증 된 프로세스를 확장 하기 위한 위해 적합 하다14. 그러나, 실내 소규모 재배 적합 한 새로운 또는 향상 된 조류 종자를 개발 하는 경우 또는 생물 학적 메커니즘을 이해 하기 위한 실험을 수행. 이 후자의 경우에서 실험 제어의 높은 학위 생물 학적 행동에 미묘한 변화 애타게 필요 합니다. 이 위해, axenic 문화 종종 필연적으로 대규모 야외 시스템에서 성장 하는 다른 생물 (예: 박테리아, 다른 조류)와 관련 된 복잡 한 생물 요소를 최소화 하기 위해 필요 합니다. 조류와 다른 유기 체 사이 상호 작용을 공부 하는 경우에 우리 생물15,,1617간의 분자 교류를 조사할 때 높은 제어 실험 조건의 사용 유용 하는 것이 나타났습니다.
소규모 실내 조류 재배의 범주 내에서 다양 한 접근은 사용 되었다. 아마도 가장 일반적인 방법은 빛 은행18,19아래 통 테이블에 삼각 플라스 크에 조류를 성장 하는 것입니다. 산소와 CO2 의 교환 플라스 크의 상단에 있는 거품 플러그를 통해 수동 확산에 의해 일어난다. 일부 연구 자들은이 설정 플라스 크20의 활성 폭 기를 통해 향상 되었습니다. 다른 방법은 병, 저 어 바와 활성 폭 기 혼합에 조류를 배양 하는 것입니다. 그들의 단순에도 불구 하 고 우리는 플라스 크 및 병의 사용 수시로 이끌어 생물 복제 간의 일관성 없는 결과 것으로 나타났습니다. 아마도 이것은 위치 효과-다른 위치로 받을 또한 반응 기 내부 온도 영향을 미치는 다른 양의 빛. 새로운 위치로 원자로의 매일 회전 수 있지만 있기 때문에 문제를 완화 하지 않습니다 조류 성장의 특정 단계 (예를 들어, 초기 지 수) 다른 사람 (예를 들어, 로그 단계) 보다 위치 효과에 더 민감한.
기술적 정교의 스펙트럼의 반대 측에 완벽 하 게 통제 상업 photobioreactors가 있습니다. 이러한 시스템은 지속적으로 모니터링 하 고 조정 조류 성장을 최적화 하는 원자로. 그들은 실시간 온도 제어, 프로그래밍 가능한 조명과 pH 제어 했습니다. 불행히도, 그들은 비싼 그리고 일반적으로 반응 기 당 몇 천 달러를 비용. 가장 과학적이 고 공학 저널 생물 복제의 결과, 여러 bioreactors의 구매 필요로 필요 합니다. 우리는 현재 여기 거품 열 원자로 시스템 연구소 규모 조류 재배에 대 한 접근 (플라스 크) 간단 하 고 정교한 완전 제어 (bioreactor) 사이 분할을 다리. 거품 열 가스 거품 상승 가스 교류를 촉진 하 여 원자로 혼합 사용 합니다. 이 이렇게 어느 정도의 조명 및 온도 제어를 제공 하지만 비용 효과적인 방법으로 이렇게 한다. 또한, 우리 생물 복제 플라스 크 또는 병 접근에 비해 통계적으로 유의 한 결과 얻기 위해 필요한 필요한 수를 줄여이 시스템 생물학 복제 중 매우 일관 된 결과 얻을 수를 발견 했다. 우리는 또한 성공적으로 조류와 박테리아21의 혼합물을 육성 하기 위해이 시스템을 사용. 조류 재배 뿐만 아니라 우리 경작된 해 조류에 중성 지질 함량을 측정 하는 절차를 개설 한다. 후자의 방법은 되었습니다22, 다른 곳에서 출판 하지만 우리가 성공적으로 그것을 사용 하는 방법에 대 한 단계별 지침을 제공 하기 위해 여기 절차를 포함.
Protocol
Representative Results
Discussion
조류를 배양 할 때 가장 중요 한 고려 사항은 유기 체 또는 생물의 그룹의 특정 요구에 대 한 이해입니다. 여기에 설명 된 재배 시스템 문화 조류 하지만 특정 비 생물 적인 요인 (온도, 미디어, pH, 빛의 강도, CO2 수준, 통 기 통풍 속도)의 넓은 범위를 사용할 수 있는 조류 생물의 필요에 조정 될 필요가 있다. Note 여기에서 설명 하는 매개 변수 클로렐라 와 Auxenochlorella의 재배를 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구에 대 한 지원은 미국 농 무부 식품 및 농업 해치 프로젝트 ALA0HIGGINS는 학장, 연구를 위한 부사장 그리고는 사무엘 Ginn 대학의 공학의 고동색 대학 사무실에 의해 제공 되었다. 지원 또한 NSF에서 제공한 CBET 1438211를 부여.
Materials
| Supplies for airlift photobioreactor setup | |||
| 1 L Pyrex bottles | Corning | 16157-191 | For bottle reactors, humidifiers |
| 1/2" hose clamp | Home Depot | UC953A | or equivalent |
| 1/4" female luer to barb | Nordson biomedical | Nordson FTLL360-6005 | 1/4" ID, PP |
| 1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50' |
| 1/4" in O-rings | Grainger | 1REC5 | #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D. |
| 1/8" Female luer to barb | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
| 1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250' |
| 1/8" male spinning luer to barb | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
| 1/8" multiport barb | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8" multiport barb |
| 1/8" NPT to barb | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8" 200 series barb |
| 1/8" panel mount luer | Nordson biomedical | Nordson MLRLB230-6005 | 1/8", PP |
| 10 gallon fish tank | Walmart | 802262 | Can hold up to 8 bioreactors depending on layout |
| 100-1000 ccm flow meter | Dwyer | RMA-13-SSV | For bottle reactors |
| 2 ft fluorescent light bank | Agrobrite | FLT24 T5 | |
| 200-2500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-14-SSV | For air regulation upstream of humidifier |
| 250 mL Pyrex bottles | Corning | 16157-136 | For gas mixing after humidifier |
| 50-500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-12-SSV | For hybridization tube reactors |
| 5-50 ccm flow meter | Dwyer | RMA-151-SSV | For CO2 flow rate control |
| Air filters 0.2 µm | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack |
| Check valves | VWR | 89094-714 | |
| Corning lids for pyrex bottles | VWR | 89000-233 | 10 GL45 lids |
| Female luer endcap | Nordson biomedical | Nordson FTLLP-6005 | Female stable PP |
| Hybridization tubes | Corning | 32645-030 | 35×300 mm, pack of 2 |
| Light timer | Walmart | 556393626 | |
| Locknuts | Nordson biomedical | Nordson LNS-3 | 1/4", red nylon |
| Low profile magnetic stirrer | VWR | 10153-690 | Low profile magnetic stirrer |
| Male luer endcap | Nordson biomedical | Nordson LP4-6005 | Male plug PP |
| Spinning luer lock ring | Nordson biomedical | Nordson FSLLR-6005 | |
| Stir bars – long | VWR | 58949-040 | 38.1 mm, for bottle reactors |
| Stir bars – medium | VWR | 58949-034 | 25 mm, for hyridization tubes |
| Supplies and reagents for culturing algae | |||
| 0.2 µm filters | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling |
| 1 mL syringes | Air-tite | 89215-216 | For filtering spent media from daily culture sampling |
| 1.5 mL tubes | VWR | 87003-294 | Sterile (or equivalent) |
| 10 mL Serological pipettes | Greiner Bio-One | 82050-482 | Sterile (or equivalent) |
| 100 mm plates | VWR | 25384-342 | 100×15 mm stackable petri dishes, sterile |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-276 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 2 mL Serological pipette tips | Greiner Bio-One | 82051-584 | Sterile (or equivalent) |
| 2 mL tubes | VWR | 87003-298 | Sterile (or equivalent) |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-348 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 96 well microplate | Greiner Bio-One | 89089-578 | Polystyrene with lid, flat bottom |
| Inocculating loops | VWR | 80094-478 | Sterile (or equivalent) |
| Liquid carbon dioxide tank and regulator | Airgas | CD-50 | |
| Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay | |||
| 2 mL bead tubes | VWR | 10158-556 | Polypropylene tube w/ lid |
| 96 well microplates | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polypropylene, flat bottom |
| Bleach | Walmart | 550646751 | Only use regular bleach, not cleaning bleach |
| Chloroform | BDH | BDH1109-4LG | |
| Dimethyl sulfoxide | BDH | BDH1115-1LP | |
| Isopropyl alcohol | BDH | BDH1133-1LP | |
| Methanol | BDH | BDH20864.400 | |
| Nile red | VWR | TCN0659-5G | |
| Pasteur pipette tips | VWR | 14673-010 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286-500G | |
| Vegetable oil | Walmart | 9276383 | Any vegetable oil should work as long as it is fresh |
| Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) | Biospec products | 11079105z | |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | XS205DU | Capable of at least 4 decimal accuracy |
| Bead homogenizer | Omni | 19-040E | |
| Benchtop micro centrifuge | Thermo | Heraeus Fresco 21 with 24×2 | Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes |
| Dry block heater | VWR | 75838-282 | Including dry block for a microplate |
| Freeze dryer | Labconco | 7670520 | 2.5L freeze drying system |
| Large benchtop centrifuge | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Capable of reading absorbance and fluorescence |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 |
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