Cultivo de microalgas verdes en fotobiorreactores de columna de burbuja y un análisis de lípidos neutros
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para construir laboratorio burbuja columna fotobiorreactores y usarlos para cultivo de microalgas. También proporciona un método para la determinación de la tasa de crecimiento del cultivo y el contenido de lípidos neutros.
Abstract
Hay gran interés en el estudio de las microalgas para aplicaciones de ingeniería tales como la producción de biocombustibles, productos de alto valor y para el tratamiento de residuos. Medida más nuevos esfuerzos de investigación a escala de laboratorio, hay una necesidad de métodos rentables para el cultivo de microalgas de forma reproducible. Aquí, nos comunicamos un enfoque efectivo para el cultivo de microalgas en fotobiorreactores de escala de laboratorio y para medir el crecimiento y contenido de lípido neutral de algas. También se incluyen instrucciones sobre cómo configurar el sistema de fotobiorreactor. Aunque los organismos ejemplo son especies de Chlorella y Auxenochlorella, se puede adaptar este sistema para cultivar una amplia gama de microalgas, incluyendo co-cultivos de algas con las especies de algas no. Culturas comunes se cultivan primero en botellas para producir inóculo para el sistema del fotobiorreactor. Inóculo de algas se concentra y transferido a fotobiorreactores para el cultivo en lotes. Las muestras se recogen diariamente de las lecturas de densidad óptica. Al final de la cultura de la hornada, las células se cosechan por centrífuga, lavado y liofilizado para obtener una concentración de peso seco final. La concentración de peso seco final se utiliza para crear una correlación entre la densidad óptica y la concentración de peso seco. Un método modificado de Folch se utiliza posteriormente para extraer los lípidos totales de la biomasa liofilizada y el extracto es analizado por su contenido de lípido neutral usando un análisis de la microplaca. Este ensayo ha sido publicado anteriormente pero pasos de protocolo se incluyeron aquí para destacar los pasos críticos en el procedimiento donde se producen frecuentemente errores. El sistema de biorreactor descrito aquí llena un nicho entre cultivo frasco simple y biorreactores comerciales totalmente controlado. Incluso con sólo 3-4 biológicos repeticiones por tratamiento, nuestro acercamiento al cultivo de algas conduce a desviaciones de estándar ajustadas en los ensayos de crecimiento y de los lípidos.
Introduction
El uso de microalgas en ingeniería y biotecnología ha atraído gran interés en los últimos años. Microalgas se están estudiando para el uso en aguas residuales tratamiento1,2,3,4, biocombustibles producción5,6,7,8y el producción de nutracéuticos y otros productos de alto valor9,10. Las algas también se están modificando genéticamente a mayores tasas en un esfuerzo por mejorar su idoneidad para aplicaciones ingeniería específica11,12 En consecuencia, hay gran interés en la experimentación con organismos industrialmente relevantes en entornos controlados. El propósito de este método es para comunicar un enfoque efectivo para el cultivo de microalgas en un entorno de laboratorio controlado y para medir el crecimiento y contenido de lípido neutral de algas. Mejorar el crecimiento de las tasas y el contenido de lípido neutral de microalgas han sido identificados como dos cuellos de botella claves hacia la comercialización de biocombustibles de algas13.
Una amplia gama de enfoques se han utilizado a las algas de la cultura para los propósitos experimentales. En general, estos enfoques se pueden dividir entre cultivo al aire libre a gran escala y pequeña escala cultivo interior. Cultivo al aire libre en estanques abiertos y en fotobiorreactores es apropiado para la experimentación a la intensificación de procesos que ya han sido probados a escala de laboratorio (por ejemplo, para probar a escala de una nueva cepa de alta de lípidos de algas)14. Sin embargo, el cultivo en pequeña escala interior es apropiado al desarrollo de cepas de algas nuevos o mejorados o realizar experimentos dirigidos a comprender los mecanismos biológicos. En estos últimos casos, es necesaria un alto grado de control experimental para provocar cambios sutiles en el comportamiento biológico. Para ello, cultivos axénicos a menudo se requieren para reducir al mínimo los complejos factores bióticos asociados con otros organismos (e.g. bacterias, otras algas) que inevitablemente crecen en sistemas al aire libre a gran escala. Incluso al estudiar las interacciones entre algas y otros organismos, hemos encontrado que el uso de condiciones experimentales altamente controladas es útil al examinar el intercambio molecular entre los organismos15,16,17.
Dentro de la categoría de cultivo de algas interiores en pequeña escala, se han utilizado una variedad de enfoques. Quizás el método más común es crecer algas en matraces de Erlenmeyer sobre una mesa coctelera debajo de un banco de luz18,19. Intercambio de oxígeno y CO2 lleva a cabo por difusión pasiva a través de un tapón de espuma en la parte superior del frasco. Algunos investigadores han mejorado este montaje una aireación activa de los matraces20. Otro método es cultivar algas en botellas, mezcladas por barra de agitación y aireación activa. A pesar de su sencillez, hemos encontrado que el uso de frascos y botellas a menudo conduce a resultados inconsistentes entre los distintos recipientes biológicos. Probablemente esto es debido a los efectos de la posición – posiciones reciben diferentes cantidades de luz, que también afectan las temperaturas del interior del reactor. Rotación diaria de reactores a nuevas posiciones puede ayudar pero no solucionar el problema porque ciertas etapas de crecimiento de las algas (por ejemplo, temprano exponencial) son más sensibles a efectos posicionales que otros (p. ej., fase de registro).
En el lado opuesto del espectro de la sofisticación tecnológica son fotobiorreactores comercial totalmente controlado. Estos sistemas continuamente monitorea y regula las condiciones en el reactor para optimizar el crecimiento de algas. Tienen iluminación programable, control de temperatura en tiempo real y control del pH. Por desgracia, son caros y por lo general cuestan varios miles de dólares por el reactor. Más revistas científicas y de ingeniería requieren replicación biológica de resultados, lo que requeriría la compra de varios Biorreactores. Aquí os presentamos un sistema de reactor de columna de burbujas que une la brecha entre el simple (matraz) y sofisticado (biorreactor totalmente controlado) se acerca para el cultivo de algas de escala de laboratorio. Columnas de burbujas utilizan burbujas de gas de levantamiento para facilitar el intercambio de gases y mezcla del reactor. Este enfoque proporciona cierto grado de control sobre la iluminación y la temperatura pero lo hace de una manera rentable. Por otra parte, hemos encontrado este sistema para producir resultados muy consistentes entre los distintos recipientes biológicos, reduciendo el número de repeticiones biológicos necesarios para obtener resultados estadísticamente significativos en comparación con el método de frasco o botella. También hemos utilizado este sistema para cultivar con éxito mezclas de algas y bacterias21. Además de cultivo de algas, describiremos un procedimiento para medir el contenido de lípidos neutros en las algas cultivadas. Este último método ha sido publicado en otro lugar22, pero incluimos aquí el procedimiento para proporcionar instrucciones paso a paso sobre cómo utilizar con éxito.
Protocol
Representative Results
Discussion
La consideración más importante al cultivo de algas es un entendimiento de las necesidades específicas del organismo o grupo de organismos. Las algas en el sistema de cultivo aquí descrito puede utilizarse para una amplia gama de las algas pero los específicos factores abióticos (temperatura, media, pH, intensidad de luz, nivel de CO2 , tasa de aireación) de la cultura deben ajustarse a las necesidades del organismo. Tenga en cuenta los parámetros aquí descritos fueron utilizados para el cultivo de <e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apoyo para esta investigación fue proporcionada por el Instituto Nacional de alimentos de USDA y agricultura Portilla proyecto ALA0HIGGINS y las oficinas de la Universidad de Auburn de preboste, el Vicepresidente para la investigación y la escuela de ingeniería de Samuel Ginn. También fue apoyado por la NSF concede CBET-1438211.
Materials
| Supplies for airlift photobioreactor setup | |||
| 1 L Pyrex bottles | Corning | 16157-191 | For bottle reactors, humidifiers |
| 1/2" hose clamp | Home Depot | UC953A | or equivalent |
| 1/4" female luer to barb | Nordson biomedical | Nordson FTLL360-6005 | 1/4" ID, PP |
| 1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50' |
| 1/4" in O-rings | Grainger | 1REC5 | #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D. |
| 1/8" Female luer to barb | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
| 1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250' |
| 1/8" male spinning luer to barb | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
| 1/8" multiport barb | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8" multiport barb |
| 1/8" NPT to barb | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8" 200 series barb |
| 1/8" panel mount luer | Nordson biomedical | Nordson MLRLB230-6005 | 1/8", PP |
| 10 gallon fish tank | Walmart | 802262 | Can hold up to 8 bioreactors depending on layout |
| 100-1000 ccm flow meter | Dwyer | RMA-13-SSV | For bottle reactors |
| 2 ft fluorescent light bank | Agrobrite | FLT24 T5 | |
| 200-2500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-14-SSV | For air regulation upstream of humidifier |
| 250 mL Pyrex bottles | Corning | 16157-136 | For gas mixing after humidifier |
| 50-500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-12-SSV | For hybridization tube reactors |
| 5-50 ccm flow meter | Dwyer | RMA-151-SSV | For CO2 flow rate control |
| Air filters 0.2 µm | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack |
| Check valves | VWR | 89094-714 | |
| Corning lids for pyrex bottles | VWR | 89000-233 | 10 GL45 lids |
| Female luer endcap | Nordson biomedical | Nordson FTLLP-6005 | Female stable PP |
| Hybridization tubes | Corning | 32645-030 | 35×300 mm, pack of 2 |
| Light timer | Walmart | 556393626 | |
| Locknuts | Nordson biomedical | Nordson LNS-3 | 1/4", red nylon |
| Low profile magnetic stirrer | VWR | 10153-690 | Low profile magnetic stirrer |
| Male luer endcap | Nordson biomedical | Nordson LP4-6005 | Male plug PP |
| Spinning luer lock ring | Nordson biomedical | Nordson FSLLR-6005 | |
| Stir bars – long | VWR | 58949-040 | 38.1 mm, for bottle reactors |
| Stir bars – medium | VWR | 58949-034 | 25 mm, for hyridization tubes |
| Supplies and reagents for culturing algae | |||
| 0.2 µm filters | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling |
| 1 mL syringes | Air-tite | 89215-216 | For filtering spent media from daily culture sampling |
| 1.5 mL tubes | VWR | 87003-294 | Sterile (or equivalent) |
| 10 mL Serological pipettes | Greiner Bio-One | 82050-482 | Sterile (or equivalent) |
| 100 mm plates | VWR | 25384-342 | 100×15 mm stackable petri dishes, sterile |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-276 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 2 mL Serological pipette tips | Greiner Bio-One | 82051-584 | Sterile (or equivalent) |
| 2 mL tubes | VWR | 87003-298 | Sterile (or equivalent) |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-348 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 96 well microplate | Greiner Bio-One | 89089-578 | Polystyrene with lid, flat bottom |
| Inocculating loops | VWR | 80094-478 | Sterile (or equivalent) |
| Liquid carbon dioxide tank and regulator | Airgas | CD-50 | |
| Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay | |||
| 2 mL bead tubes | VWR | 10158-556 | Polypropylene tube w/ lid |
| 96 well microplates | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polypropylene, flat bottom |
| Bleach | Walmart | 550646751 | Only use regular bleach, not cleaning bleach |
| Chloroform | BDH | BDH1109-4LG | |
| Dimethyl sulfoxide | BDH | BDH1115-1LP | |
| Isopropyl alcohol | BDH | BDH1133-1LP | |
| Methanol | BDH | BDH20864.400 | |
| Nile red | VWR | TCN0659-5G | |
| Pasteur pipette tips | VWR | 14673-010 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286-500G | |
| Vegetable oil | Walmart | 9276383 | Any vegetable oil should work as long as it is fresh |
| Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) | Biospec products | 11079105z | |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | XS205DU | Capable of at least 4 decimal accuracy |
| Bead homogenizer | Omni | 19-040E | |
| Benchtop micro centrifuge | Thermo | Heraeus Fresco 21 with 24×2 | Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes |
| Dry block heater | VWR | 75838-282 | Including dry block for a microplate |
| Freeze dryer | Labconco | 7670520 | 2.5L freeze drying system |
| Large benchtop centrifuge | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Capable of reading absorbance and fluorescence |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 |
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