中性脂質のバブル列フォトバイオリアクターとアッセイで緑の微細藻類の栽培
Summary
ここでは、ラボスケール バブル列フォトバイオリアクターを構築および微細藻類培養に使用するプロトコルを提案する.文化成長率と中性脂質含量の定量のためのメソッドも提供します。
Abstract
廃棄物処理、バイオ燃料、高付加価値製品の製造などエンジニア リング アプリケーションのための微細藻類の研究に大きな関心があります。ほとんどの新しい研究努力は、実験室規模で開始、再現可能な方法で微細藻類を培養するためのコスト効果の高い方法の必要性があります。ここでは、我々 は微細藻類培養実験室規模フォトバイオリアクターと成長、その藻の中性脂質含量を測定するための効果的な方法を伝えます。指示は、フォトバイオリアクター システムを設定する方法についても含まれます。例の生物がクロレラとAuxenochlorellaの種、幅広い非藻類種の藻類の共培養を含む微細藻類を育成するこのシステムを合わせることができます。株式文化最初フォトバイオリアクターにおける菌の生成するボトルで栽培しています。藻類は集中し、フォトバイオリアクター バッチ モードでの栽培のために転送。サンプルは光学濃度測定のため毎日収集されます。バッチ文化の終わり、セル洗浄、遠心分離機による収穫、凍結乾燥、最終的な乾燥重量濃度。最終的な乾燥重量濃度を使用して、光学濃度と乾燥重量濃度の間の相関関係を作成します。Folch 法の改良はその後凍結乾燥バイオマスから総脂質を抽出するため、抽出物はマイクロ プレート法を用いた中性脂質内容の検定します。このアッセイは、以前公開されているが、プロトコルの手順は、エラーが頻繁に発生する重要な手順を強調するここに含まれていた。ここで説明したバイオリアクター システムは、単純なフラスコ栽培と商業のバイオリアクターを完全に制御のニッチを埋めます。治療あたり 3-4 生物だけでも複製、藻類を培養へのアプローチは、成長と脂質の試金でタイトな標準偏差に 。
Introduction
工学とバイオ テクノロジーで微細藻類のアプリケーションは、近年大きな関心を集めています。微細藻類が排水処理1,2,3,4、バイオ燃料生産5,6,7,8で使用するため研究されていると栄養補助食品・その他価値の高い製品9,10の生産。藻類も遺伝的変更される大きい率で特定のエンジニア リング アプリケーションの11,12の健康を改善するために。その結果、制御された設定で工業的に関連する生物の実験には大きな関心があります。このメソッドの目的は、管理された実験室では、文化の微細藻類に効果的なアプローチし成長とその藻の中性脂質含量を測定します。成長の改善率と微細藻類の中性脂質含量は13藻類バイオ燃料の実用化に向けた 2 つのキーのボトルネックとして識別されています。
幅広いアプローチは実験目的のため藻類培養に使用されています。一般に、これらのアプローチは大規模屋外栽培と小規模の屋内栽培の分けることができます。フォトバイオリアクターと開いている池で屋外栽培は実験室規模 (例えば藻類の新種高脂質のスケール アップをテストするため) に既に実績のあるプロセスをスケール アップを目的とした実験に適した14。ただし、屋内の小規模栽培は適切な新規または改善された藻類系統の開発時または生物学的メカニズムを理解することを目的とした実験を行います。これらの後者の場合生物学的態度の微妙な変化を引き出す心理学実験制御の高度が必要です。そのため、無菌共生栽培多くの場合必然的に大規模な屋外における拡張他の生物 (例えば細菌、他の藻類) に関連付けられている複雑な生物的要因を最小限に抑えるために必要があります。藻類や他の生物間の相互作用を学ぶ時でさえ、分子生物15,16,17交流を調べる実験条件の高度制御の使用が役立つことがわかりました。
小規模な屋内藻類栽培のカテゴリ内でのアプローチの範囲が使用されています。おそらく最も一般的なアプローチは、光銀行18,19下シェーカー テーブルの上のエルレンマイヤー フラスコで藻を成長することです。フラスコの上部に泡のプラグインを介して受動拡散によって酸素と CO2の交換が行われる。一部の研究者は、フラスコ20のアクティブな通気によってこの設定を改善しています。攪拌棒とアクティブな通気によって混合ボトルで藻類を育成する方法です。そのシンプルさにもかかわらず、我々 はフラスコやボトルの使用がしばしば生物複製間の一貫性のない結果につながることを発見しました。おそらくこれは位置の影響によるものです – 別の位置を受け取るまた炉内温度に影響を与える光の量が異なる。新しい位置に原子炉の毎日のローテーションは助けることが問題を軽減しないので藻類の成長の特定の段階 (例えば、早期指数) 他 (例えば、ログ フェーズ) よりポジショニング エフェクトにより敏感します。
技術的に洗練されたスペクトルの反対側にある商業のフォトバイオリアクターを完全に制御これらのシステムは継続的に監視し、藻類の成長を最適化するために原子炉で条件を調整します。プログラム可能な照明、リアルタイム温度コントロール、および pH コントロールがあります。残念なことに、彼らは高価であり、通常原子炉あたり数千ドルの費用。最も科学的なおよび工学のジャーナルは複数バイオリアクターの購入を施行した結果の生物学的レプリケーションを必要とします。ここでは提示バブル列原子炉システム シンプル (フラスコ) と高度 (バイオリアクターの完全に制御) 間の格差ラボ スケール藻類栽培へのアプローチその橋。ガス交換を促進し、原子炉をミックスする気泡上昇気泡列を使用します。このアプローチは、照明と温度制御のある程度を提供しますがコスト効率の高い方法で 。さらに、我々 はフラスコやボトルのアプローチと比較して統計的に有意な結果を得るために必要な生物学的複製の必要数を減らすこと生物的複製の間で非常に一貫した結果が得られるこのシステムを発見しました。また正常に藻類と細菌21の混合物を育成するこのシステムを使いました。藻類栽培に加えて培養藻の中性脂質含量を測定するための手順の概要を説明します。後者の方法はされている22、他の場所で公開されたが、我々 は正常にそれを使用する方法の詳細な手順を提供するためにここでプロシージャを含めます。
Protocol
Representative Results
Discussion
藻類を培養する際に最も重要な生物または生物のグループの特定のニーズを理解しています。藻類が特定の非生物的要因 (温度、メディア、pH、光量、CO2レベルの通気率) の広い範囲の文化をここで説明した栽培システムを使用ことができます藻類は生物のニーズを調整する必要があります。クロレラとAuxenochlorellaの耕作のために使用されたここで説明したパラメーター?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究のためのサポートは、米国農務省国立食品研究所と農業ハッチ プロジェクト ALA0HIGGINS、学長、研究では、副社長とサミュエル モビルジン工学大学のオーバーン大学のオフィスによって提供されました。サポートは、NSF によって提供されたもあわせて 1438211 を付与します。
Materials
| Supplies for airlift photobioreactor setup | |||
| 1 L Pyrex bottles | Corning | 16157-191 | For bottle reactors, humidifiers |
| 1/2" hose clamp | Home Depot | UC953A | or equivalent |
| 1/4" female luer to barb | Nordson biomedical | Nordson FTLL360-6005 | 1/4" ID, PP |
| 1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50' |
| 1/4" in O-rings | Grainger | 1REC5 | #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D. |
| 1/8" Female luer to barb | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
| 1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250' |
| 1/8" male spinning luer to barb | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
| 1/8" multiport barb | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8" multiport barb |
| 1/8" NPT to barb | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8" 200 series barb |
| 1/8" panel mount luer | Nordson biomedical | Nordson MLRLB230-6005 | 1/8", PP |
| 10 gallon fish tank | Walmart | 802262 | Can hold up to 8 bioreactors depending on layout |
| 100-1000 ccm flow meter | Dwyer | RMA-13-SSV | For bottle reactors |
| 2 ft fluorescent light bank | Agrobrite | FLT24 T5 | |
| 200-2500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-14-SSV | For air regulation upstream of humidifier |
| 250 mL Pyrex bottles | Corning | 16157-136 | For gas mixing after humidifier |
| 50-500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-12-SSV | For hybridization tube reactors |
| 5-50 ccm flow meter | Dwyer | RMA-151-SSV | For CO2 flow rate control |
| Air filters 0.2 µm | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack |
| Check valves | VWR | 89094-714 | |
| Corning lids for pyrex bottles | VWR | 89000-233 | 10 GL45 lids |
| Female luer endcap | Nordson biomedical | Nordson FTLLP-6005 | Female stable PP |
| Hybridization tubes | Corning | 32645-030 | 35×300 mm, pack of 2 |
| Light timer | Walmart | 556393626 | |
| Locknuts | Nordson biomedical | Nordson LNS-3 | 1/4", red nylon |
| Low profile magnetic stirrer | VWR | 10153-690 | Low profile magnetic stirrer |
| Male luer endcap | Nordson biomedical | Nordson LP4-6005 | Male plug PP |
| Spinning luer lock ring | Nordson biomedical | Nordson FSLLR-6005 | |
| Stir bars – long | VWR | 58949-040 | 38.1 mm, for bottle reactors |
| Stir bars – medium | VWR | 58949-034 | 25 mm, for hyridization tubes |
| Supplies and reagents for culturing algae | |||
| 0.2 µm filters | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling |
| 1 mL syringes | Air-tite | 89215-216 | For filtering spent media from daily culture sampling |
| 1.5 mL tubes | VWR | 87003-294 | Sterile (or equivalent) |
| 10 mL Serological pipettes | Greiner Bio-One | 82050-482 | Sterile (or equivalent) |
| 100 mm plates | VWR | 25384-342 | 100×15 mm stackable petri dishes, sterile |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-276 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 2 mL Serological pipette tips | Greiner Bio-One | 82051-584 | Sterile (or equivalent) |
| 2 mL tubes | VWR | 87003-298 | Sterile (or equivalent) |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-348 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 96 well microplate | Greiner Bio-One | 89089-578 | Polystyrene with lid, flat bottom |
| Inocculating loops | VWR | 80094-478 | Sterile (or equivalent) |
| Liquid carbon dioxide tank and regulator | Airgas | CD-50 | |
| Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay | |||
| 2 mL bead tubes | VWR | 10158-556 | Polypropylene tube w/ lid |
| 96 well microplates | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polypropylene, flat bottom |
| Bleach | Walmart | 550646751 | Only use regular bleach, not cleaning bleach |
| Chloroform | BDH | BDH1109-4LG | |
| Dimethyl sulfoxide | BDH | BDH1115-1LP | |
| Isopropyl alcohol | BDH | BDH1133-1LP | |
| Methanol | BDH | BDH20864.400 | |
| Nile red | VWR | TCN0659-5G | |
| Pasteur pipette tips | VWR | 14673-010 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286-500G | |
| Vegetable oil | Walmart | 9276383 | Any vegetable oil should work as long as it is fresh |
| Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) | Biospec products | 11079105z | |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | XS205DU | Capable of at least 4 decimal accuracy |
| Bead homogenizer | Omni | 19-040E | |
| Benchtop micro centrifuge | Thermo | Heraeus Fresco 21 with 24×2 | Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes |
| Dry block heater | VWR | 75838-282 | Including dry block for a microplate |
| Freeze dryer | Labconco | 7670520 | 2.5L freeze drying system |
| Large benchtop centrifuge | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Capable of reading absorbance and fluorescence |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 |
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