טיפוח של ירוק Microalgae בועה עמודה Photobioreactors ואת וזמינותו עבור ליפידים נייטרלי

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבנות מעבדה-סולם בועה עמודה photobioreactors ולהשתמש בהן כדי microalgae תרבות. הוא מספק גם שיטה לקביעת שיעור הצמיחה תרבות ותוכן השומנים נייטרלי.

Abstract

יש עניין משמעותי במחקר של microalgae ליישומים הנדסיים כגון הייצור של דלק ביולוגי, מוצרים בעלי ערך גבוה, ועל לטיפול של פסולת. כמו רוב מאמצי מחקר חדש להתחיל בקנה מידה מעבדה, יש צורך שיטות חסכונית culturing microalgae באופן לשחזור. כאן, אנו מתקשרים גישה יעילה microalgae התרבות במעבדה-מידה photobioreactors, וכדי למדוד את הצמיחה ואת תוכן שומני נייטרלי של אצות הזה. הוראות כלולות גם על כיצד להגדיר את המערכת photobioreactor. למרות האורגניזמים דוגמה מינים של כלורלה , Auxenochlorella, ניתן להתאים מערכת זו לטפח מגוון רחב של microalgae, כולל תרבויות המשנה של אצות עם מינים שאינם אצות. תרבויות מניות קודם גדלים בקבוקים כדי לייצר inoculum של המערכת photobioreactor. אצות inoculum מרוכז, הועבר photobioreactors לטיפוח במצב אצווה. דוגמאות נאספים מדי יום עבור המקראות צפיפות אופטית. בקצה של התרבות אצווה, התאים נקצרים על ידי צנטריפוגה, שטף, להקפיא מיובש בריכוז סופי משקל יבש. הריכוז הסופי משקל יבש משמשת ליצירת מתאם בין הצפיפות האופטית ריכוז משקל יבש. שיטה Folch ששונה משתמשים לאחר מכן לחלץ סה כ שומנים ביומסה הליחה, התמצית הוא לבדיקה לתוכן נייטרלי השומנים שלה באמצעות וזמינותו של microplate. זה וזמינותו שפורסם בעבר אבל פרוטוקול צעדים נכללו כאן כדי להדגיש שלבים קריטיים בהליך שבו מתרחשות לעתים קרובות שגיאות. מערכת ביוריאקטור המתוארים כאן ממלא את הנישה שלו בין טיפוח פשוטה את הבקבוק שבשליטת מלא מסחרית ריאקטורים. מעתיק. אפילו עם רק 3-4 ביולוגית לכל טיפול, גישת culturing אצות מוביל חזק סטיות תקן ב מבחני וצמיחה של השומנים.

Introduction

היישום של microalgae הנדסה וביוטכנולוגיה משכה עניין רב בשנים האחרונות. Microalgae נלמדים לשימוש בשפכים טיפול^1,2,3,4, biofuel הייצור^5,6,7,8, ו ייצור בריאותיים, אחרים^9,מוצרים בעלי ערך גבוה¹⁰. אצות הן גם להיות מהונדסים גנטית במחירים גדול במאמץ לשפר את כושר ספציפי הנדסי יישומי^11,12. כתוצאה מכך, יש עניין רב בניסויים עם תעשייתי הרלוונטיות האורגניזמים בהגדרות מבוקרת. מטרת שיטה זו היא לתקשר גישה יעילה microalgae תרבות בסביבה מעבדתית מבוקרת, וכדי למדוד את הצמיחה ואת תוכן שומני נייטרלי של אצות הזה. שיפור צמיחת המחירים ותוכן השומנים נייטרלי microalgae זוהו שני צווארי בקבוק המפתח לכיוון מסחור של דלק ביולוגי אצה¹³.

מגוון רחב של גישות שימשו התרבות אצות למטרות ניסוי. באופן כללי, גישות אלה ניתן לחלק בין טיפוח חיצונית בקנה מידה גדול טיפוח מקורה בקנה מידה קטן. חיצונית בטיפוח photobioreactors ובריכות פתוחות מתאימה עבור ניסויים מכוונים קנה מידה את התהליכים כבר הוכחו בקנה מידה מעבדה (למשל, כדי לבדוק את הסולם של מתח גבוה-השומנים החדש של אצות)¹⁴. אולם, טיפוח בקנה מידה קטן מקורה מתאים בעת פיתוח זנים חדשים או משופרים אצות או ביצוע ניסויים שמטרתם להבין מנגנונים ביולוגיים. במקרים אלה האחרונים, רמה גבוהה של שליטה ניסויית נדרש לבדוק שינויים עדינים התנהגות ביולוגית. לשם כך, תרבויות axenic נדרשים לעיתים קרובות על מנת לצמצם את הגורמים ביוטיים מורכבים הקשורים אורגניזמים אחרים (למשל חיידקים, אצות אחרות) אשר גדלים באופן בלתי נמנע במערכות חיצוניות בקנה מידה גדול. גם כאשר הלומדים אינטראקציות בין אצות ואורגניזמים אחרים, מצאנו כי תנאי ניסוי מבוקר מאוד שימושי כאשר בוחנים exchange מולקולרי בין אורגניזמים^15,16,17.

בקטגוריה של טיפוח אצות מקורה בקנה מידה קטן, שימשו מגוון של גישות. אולי הגישה הנפוצה ביותר היא לגדל אצות Erlenmeyer המבחנות על שולחן שאכר מתחת הבנק אור^18,19. החליפין של חמצן ו- CO₂ מתקיים על ידי דיפוזיה פסיבית דרך פקק קצף בחלק העליון של הבקבוק. יש חוקרים שיפרו את הגדרת דרך לערבב פעיל מתוך מבחנות²⁰. גישה אחרת היא לטפח אצות בקבוקים, מיקס על ידי ובר מערבבים לערבב פעיל. למרות הפשטות שלהם, מצאנו כי השימוש מימיות ובקבוקי מובילה לעיתים קרובות תוצאות לא עקביות בין משכפל ביולוגי. ככל הנראה זאת בשל המיקום אפקטים – עמדות שונות לקבל כמויות שונות של אור, אשר גם להשפיע על הכור הפנימי טמפרטורות. הסיבוב היומי של כורים למיקומים חדשים יכול לעזור אבל לא להקל על הבעיה כי בשלבים מסוימים של גידול אצות (למשל, מוקדם מעריכית) רגישים יותר להשפעות מיקומיים יותר מהאחרים (למשל, שלב יומן).

בצד השני של הספקטרום של תחכום טכנולוגי נמצאים בשליטה מלאה photobioreactors מסחרי. מערכות אלו ללא הרף לעקוב ולהתאים את התנאים לכור כדי למטב את גידול אצות. יש להם תאורה הניתן לתכנות, בקרת טמפרטורה בזמן אמת ושליטה pH. למרבה הצער, הם יקרים, בדרך כלל עלות כמה אלפי דולרים לכל כור. כתבי עת מדעיים והנדסיים ביותר דורשים שכפול הביולוגי של תוצאות, המחייב רכישת ריאקטורים מרובים. אנו מציגים כאן מערכת הכור בועה עמודה הגשרים את הפער בין פשוטה (הבקבוק) מתוחכם (בשליטה מלאה ביוריאקטור) מתקרב לטיפוח אצות בקנה מידה מעבדה. אכסדרת בועות להשתמש בעליה בועות גז כדי להקל על חילוף הגזים ומערבבים את הכור. גישה זו מספקת מידה מסוימת של שליטה תאורה וטמפרטורה אך עושה זאת באופן חסכוני. יתר על כן, מצאנו את מערכת זו להניב תוצאות עקביות גבוהה בקרב משכפל ביולוגי, הפחתת את המספר הנדרש של משכפל ביולוגי הדרושים על מנת להשיג תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית לעומת הגישה את הבקבוק או בקבוק. השתמשנו גם מערכת זו לטפח בהצלחה תערובות של אצות, חיידקים²¹. בנוסף טיפוח אצות, אנחנו חלוקה לרמות הליך למדידת את תכולת השומנים נייטרלי האצות בתרבית. השיטה השנייה כבר שפורסם במקומות אחרים²², אך אנו כוללים את ההליך פה לספק הוראות שלב אחר שלב כיצד להעסיק אותו בהצלחה.

Protocol

1. כיוונון של בועה עמודה Photobioreactors לבנות סט של העפעפיים פרקו מן עפעפיו פלסטיק שהגיע עם בקבוקי זכוכית 1 ליטר וצינורות הכלאה (לקבלת מפרטים טכניים ותמונות, ראה איור 1 ). לבנות מכסים עבור מעשיר, ערבוב מלכודת כל photobioreactor מעלית אויר, כל בכור בקבוק. קודחים חורים ¼” המכסה: 2 חור?…

Representative Results

הליך זה מניב קורס זמן של נתוני צפיפות אופטית אצה-OD 550 ננומטר (איור 4A). צפיפות אופטית ואת משקל יבש ריכוז נתונים יכול להיות בקורלציה (איור 4B). זו מושגת על-ידי הראשונה חישוב ריכוז האצות משקל יבש הסופי לאחר השלב להקפיא ייבוש. בשלב הבא, הצפיפות האו?…

Discussion

השיקול החשוב ביותר כאשר culturing אצות היא הבנה של צרכים הספציפיים של אורגניזם או קבוצה של אורגניזמים. האצות שיטת הטיפוח המתוארים כאן יכול לשמש כדי תרבות מגוון רחב של אצות אבל הגורמים והאביוטיים ספציפי (טמפרטורה, מדיה, pH, עוצמת האור, רמה₂ CO, לערבב קצב) צריכים להיות מותאמים לצרכים של האורגנ?…

Materials

Supplies for airlift photobioreactor setup
1 L Pyrex bottles	Corning	16157-191	For bottle reactors, humidifiers
1/2" hose clamp	Home Depot	UC953A	or equivalent
1/4" female luer to barb	Nordson biomedical	Nordson FTLL360-6005	1/4" ID, PP
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing	Thermo-Nalgene	63013-244	50'
1/4" in O-rings	Grainger	1REC5	#010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
1/8" Female luer to barb	Nordson biomedical	FTLL230-6005
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing	Thermo-Nalgene	63013-608	250'
1/8" male spinning luer to barb	Nordson biomedical	MLRL013-6005
1/8" multiport barb	Nordson biomedical	4PLL230-6005	1/8" multiport barb
1/8" NPT to barb	Nordson biomedical	18230-6005	1/8" 200 series barb
1/8" panel mount luer	Nordson biomedical	Nordson MLRLB230-6005	1/8", PP
10 gallon fish tank	Walmart	802262	Can hold up to 8 bioreactors depending on layout
100-1000 ccm flow meter	Dwyer	RMA-13-SSV	For bottle reactors
2 ft fluorescent light bank	Agrobrite	FLT24 T5
200-2500 ccm flow meter	Dwyer	RMA-14-SSV	For air regulation upstream of humidifier
250 mL Pyrex bottles	Corning	16157-136	For gas mixing after humidifier
50-500 ccm flow meter	Dwyer	RMA-12-SSV	For hybridization tube reactors
5-50 ccm flow meter	Dwyer	RMA-151-SSV	For CO2 flow rate control
Air filters 0.2 µm	Whatman/ Fisher	09-745-1A	Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack
Check valves	VWR	89094-714
Corning lids for pyrex bottles	VWR	89000-233	10 GL45 lids
Female luer endcap	Nordson biomedical	Nordson FTLLP-6005	Female stable PP
Hybridization tubes	Corning	32645-030	35×300 mm, pack of 2
Light timer	Walmart	556393626
Locknuts	Nordson biomedical	Nordson LNS-3	1/4", red nylon
Low profile magnetic stirrer	VWR	10153-690	Low profile magnetic stirrer
Male luer endcap	Nordson biomedical	Nordson LP4-6005	Male plug PP
Spinning luer lock ring	Nordson biomedical	Nordson FSLLR-6005
Stir bars – long	VWR	58949-040	38.1 mm, for bottle reactors
Stir bars – medium	VWR	58949-034	25 mm, for hyridization tubes
Supplies and reagents for culturing algae
0.2 µm filters	VWR	28145-491	13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling
1 mL syringes	Air-tite	89215-216	For filtering spent media from daily culture sampling
1.5 mL tubes	VWR	87003-294	Sterile (or equivalent)
10 mL Serological pipettes	Greiner Bio-One	82050-482	Sterile (or equivalent)
100 mm plates	VWR	25384-342	100×15 mm stackable petri dishes, sterile
15 mL tubes	Greiner Bio-One	82050-276	Sterile (or equivalent), polypropylene
2 mL Serological pipette tips	Greiner Bio-One	82051-584	Sterile (or equivalent)
2 mL tubes	VWR	87003-298	Sterile (or equivalent)
50 mL tubes	Greiner Bio-One	82050-348	Sterile (or equivalent), polypropylene
96 well microplate	Greiner Bio-One	89089-578	Polystyrene with lid, flat bottom
Inocculating loops	VWR	80094-478	Sterile (or equivalent)
Liquid carbon dioxide tank and regulator	Airgas	CD-50
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay
2 mL bead tubes	VWR	10158-556	Polypropylene tube w/ lid
96 well microplates	Greiner Bio-One	82050-774	Polypropylene, flat bottom
Bleach	Walmart	550646751	Only use regular bleach, not cleaning bleach
Chloroform	BDH	BDH1109-4LG
Dimethyl sulfoxide	BDH	BDH1115-1LP
Isopropyl alcohol	BDH	BDH1133-1LP
Methanol	BDH	BDH20864.400
Nile red	VWR	TCN0659-5G
Pasteur pipette tips	VWR	14673-010
Sodium chloride	BDH	BDH9286-500G
Vegetable oil	Walmart	9276383	Any vegetable oil should work as long as it is fresh
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter)	Biospec products	11079105z
Equipment
Analytical balance	Mettler-Toledo	XS205DU	Capable of at least 4 decimal accuracy
Bead homogenizer	Omni	19-040E
Benchtop micro centrifuge	Thermo	Heraeus Fresco 21 with 24×2	Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes
Dry block heater	VWR	75838-282	Including dry block for a microplate
Freeze dryer	Labconco	7670520	2.5L freeze drying system
Large benchtop centrifuge	Thermo	Heraeus Megafuge 16R Tissue	Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax M2	Capable of reading absorbance and fluorescence
Vortex mixer	VWR	10153-838