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Cancer Research

हेपेटोकोशिक सूजन और फाइब्रोसिस की स्थापना में उत्पन्न होने वाले हेपैटोकोशिक कैंसर के एक ओंकोजेनिक हेप्टोसाइट-प्रेरित ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/59368
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Surgery, University of Missouri-Columbia, 2Ellis Fischel Cancer Center, University of Missouri-Columbia, 3Molecular Microbiology and Immunology, University of Missouri-Columbia
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम यकृत कैंसर के एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक murine मॉडल के विकास का वर्णन hepatotocellular कैंसर (HCC) की विशिष्ट प्रतिरक्षा सुविधाओं recapitulating.

Abstract

एक चिकित्सकीय प्रासंगिक पशु मॉडल hepatocellular कैंसर (एचसीसी) की विशिष्ट प्रतिरक्षा विशेषताओं को संबोधित की अनुपस्थिति काफी अंतर्निहित तंत्र और अभिनव इम्यूनोथैरेपी रणनीतियों के विकास के स्पष्टीकरण में बाधा उत्पन्न की है. मानव एचसीसी को फिर से जीवित करने के लिए एक आदर्श पशु मॉडल विकसित करने के लिए, इम्यूनोसक्षम पुरुष C57BL/6J चूहों को पहले यकृत फाइब्रोसिस प्रेरित करने के लिए एक कार्बन टेट्राक्लोराइड (सीसीएल4) इंजेक्शन प्राप्त होता है, फिर युवा पुरुष से हिस्टोलॉजिकल-सामान्य ओनकोजेनिक हेपाटोसाइट्स प्राप्त करते हैं SV40 टी प्रतिजन (TAg)-ट्रांसजेनिक चूहों (MTD2) द्वारा अंतर-स्प्लेनिक (ISPL) टीका. यौवन पर प्राप्तकर्ता पुरुष चूहों में उत्पन्न एण्ड्रोजन एक जिगर विशेष प्रमोटर के नियंत्रण में TAg अभिव्यक्ति आरंभ. नतीजतन, स्थानांतरित hepatocytes कैंसर की कोशिकाओं बन जाते हैं और लीवर फाइब्रोसिस की स्थापना में ट्यूमर जनता के रूप में / यह उपन्यास मॉडल लीवर फाइब्रोसिस/सिरोसिस के संदर्भ में मानव एचसीसी दीक्षा और प्रगति की नकल करता है और प्रतिरक्षा रोग सहित मानव एचसीसी की सबसे विशिष्ट विशेषताओं को दर्शाता है।

Introduction

Hepatotocellular कैंसर (एचसीसी) संयुक्त राज्य अमेरिका (अमेरिका)1,2,3में कैंसर का सबसे तेजी से बढ़ती प्रकार है । हर साल , लगभग 850,000 नए मामलों का निदान कर रहे हैं4,5 और 700,000 रोगियों को इस घातक बीमारी से मर6,7,8,9,10 , यह दुनिया भर में कैंसर से संबंधित मौत का दूसरा सबसे बड़ा कारण बना. एचसीसी के प्रबंधन में सर्जिकल लकीर, प्रत्यारोपण, ablation, chemoembolization, या प्रणालीगत चिकित्सा, जैसे sorafenib11शामिल हैं। शल्य ीय लकीर या प्रत्यारोपण के साथ प्रारंभिक निदान और प्रबंधन में सबसे अधिक समग्र जीवित रहने का लाभ4होता है . दुर्भाग्य से, रोगियों के बहुमत एक बाद के चरण में मौजूद है और ablation, chemoembolization या sorafenib12के साथ प्रबंधन की आवश्यकता है. Sorafenib, एक रिसेप्टर tyrosine kinase अवरोध करनेवाला (RTKI), खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा 2008 में केवल प्रणालीगत दवा चिकित्सा unresectable एचसीसी के इलाज के लिए उपलब्ध के रूप में अनुमोदित किया गया था. हालांकि दवा केवल समग्र अस्तित्व में एक मामूली वृद्धि प्रदान करता है, 7.9 से 10.7 महीने13,यह एक नई चिकित्सीय रणनीति है कि एचसीसी का प्रबंधन करने के लिए उपयोग किया जा सकता प्रदान की.

स्थापित कैंसर को खत्म करने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली में हेरफेर कैंसर अनुसंधान14में तेजी से बढ़ रहा क्षेत्र है . प्रतिरक्षा जांच चौकी के अध्ययनों से कैंसर के उपचार में इम्यूनोथैरेपी दवा का विकास काफी उन्नतहुआ है 15,16. एफडीए साइटोटॉक्सिक टी-लिम्फोसाइट प्रतिजन 4 (CTLA-4), क्रमादेशित सेल मौत प्रोटीन 1 (पीडी-1) के खिलाफ एंटीबॉडी (एब्स) के उपयोग को मंजूरी दे दी, और मेलेनोमा के उपचार के लिए इसके ligand पीडी-L1, फेफड़ों के कैंसर, सिर और गर्दन के कैंसर, और मूत्राशय के कैंसर17, 18 , 19 , 20. उन्नत एचसीसी के उपचार के लिए पीडी-1, पीडी-एल 1 या CTLA-4 के खिलाफ एक या एकाधिक एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए मोनोथेरेपी या संयोजन चिकित्सा के नैदानिक परीक्षण चल रहे हैं21,22,23, और कुछ परीक्षणों ने अनुकूल परिणाम दिखाए हैं। 2017 में, एफडीए ने एचसीसी रोगियों के इलाज के लिए एंटी-पीडी-1 एंटीबॉडी के लिए त्वरित अनुमोदन प्रदान किया, जो सोराफेनिब के प्रतिरोध कर रहे हैं, लेकिन इस चिकित्सा की समग्र प्रतिक्रिया दर केवल 14.3% है। अन्य रणनीतियों का इस समय नैदानिक अभ्यास में अनुवाद नहीं किया गया है24,25. ट्यूमर प्रेरित गहन प्रतिरक्षा सहिष्णुता पर काबू पाने प्रतिरक्षा जांच की चौकी चिकित्सा में सुधार करने के लिए26; प्रतिरक्षा जांच की चौकी चिकित्सा की प्रभावकारिता की भविष्यवाणी; प्रतिरक्षा से संबंधित प्रतिकूल घटनाओं को रोकने; अनुकूलन प्रशासन मार्ग, खुराक, और आवृत्ति; और चिकित्सा के प्रभावी संयोजन खोजने27,28,29 सभी अत्यंत चुनौतीपूर्ण कार्य रहते हैं.

वर्तमान में माउस मॉडल में एचसीसी को प्रेरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कई पारंपरिक दृष्टिकोण हैं और अन्वेषक के विशेष अनुसंधान प्रश्न30के आधार पर उपयोग किया जाता है। जीनोटॉक्सिक यौगिकों के साथ रासायनिक प्रेरित एचसीसी माउस मॉडल चोट प्रेरित द्रोह की नकल करते हैं। एचसीसी सेल लाइनों के या तो अस्थानिक या ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के माध्यम से Xenograft मॉडल दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त हैं। आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की एक संख्या एचसीसी के pathophysiology की जांच करने के लिए इंजीनियर किया गया है. ट्रांसजेनिक चूहों वायरल जीन व्यक्त, oncogenes और / या विकास कारकों hepatocarcinogenesis में शामिल रास्ते की पहचान की अनुमति देते हैं. अंतर्निहित सीमाओं के कारण, इन मॉडलों को मानव एचसीसी में देखा ठेठ प्रतिरक्षा विशेषताओं recapitulate नहीं है, जो काफी अंतर्निहित तंत्र और अभिनव इम्यूनोथैरेपी रणनीतियों के विकास के स्पष्टीकरण में बाधा उत्पन्न की है14 ,15. हमने हाल ही में एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक murine मॉडल बनाया है. इस उपन्यास मॉडल न केवल मानव एचसीसी दीक्षा और प्रगति mimics लेकिन यह भी प्रतिरक्षा रोग सहित मानव रोग की सबसे विशिष्ट सुविधाओं को दर्शाता है. हम अपनी जैविक और प्रतिरक्षा विशेषताओं की विशेषता है. इस उपन्यास मॉडल का लाभ उठाते हुए हमने एचसीसी31,32,33,34,35,36के इलाज के लिए विभिन्न इम्यूनोथैरेपी रणनीतियों का पता लगाया है, 37.यह अनूठा मंच हमें ट्यूमर प्रेरित इम्यूनोटॉरेशन के तंत्र का अध्ययन करने और अंतिम नैदानिक अनुवाद की ओर एचसीसी के लिए सबूत के अवधारणा चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने की अनुमति देता है।

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Protocol

नोट: पशु विषयों सहित सभी प्रक्रिया मिसौरी विश्वविद्यालय में IACUC द्वारा अनुमोदित किया गया है. सभी चूहों "की देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड" में उल्लिखित मानदंडों के अनुसार मानवीय देखभाल प्राप्त किया। सेल अलगाव और टीका के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया एक हुड में किया जाना चाहिए. सभी कलाकारों चूहों और ऊतकों से निपटने के लिए मानक व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनना चाहिए.

1. कार्बन टेट्राक्लोराइड के आईपी इंजेक्शन के साथ लिवर फाइब्रोसिस और सिरोसिस का प्रेरण (सीसीएल4)

नोट: चित्र 1 देखें. (सीसीएल4 अत्यधिक खतरनाक अभिकर्मक है, इसे सावधानी से और रासायनिक प्रतिरोधी दस्ताने पहनने के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए)

  1. पुरुष C57BL/6J चूहों कि छह से आठ सप्ताह पुराने हैं प्राप्त करें (सामग्री की तालिकादेखें).
  2. एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में मकई के तेल में 10% CCl4 (v/v) घोल तैयार कीजिए। इंजेक्शन किया जा करने के लिए चूहों की संख्या के आधार पर कुल मात्रा निर्धारित (चरण 1.6 देखें).
  3. इंजेक्शन के लिए एक माउस का चयन करने के लिए उपयुक्त चूहों हैंडलिंग तकनीक का उपयोग करें।
  4. मैन्युअल रूप से अपने पृष्ठीय (एब्डोमेन) पक्ष के साथ माउस को नियंत्रित करें।
  5. 70% शराब के साथ scrubbing द्वारा माउस के पेट की दीवार पर इंजेक्शन साइट साफ.
  6. एक 25 गेज डिस्पोजेबल सुई का उपयोग कर इंट्रापेरिटोनल (आईपी) इंजेक्शन द्वारा 10% CCl4 समाधान के 160 $L के साथ पुरुष C57BL/6J चूहों इंजेक्शन।
  7. सुनिश्चित करें कि सुई सिर्फ पेट की दीवार के माध्यम से प्रवेश (लगभग 4-5 मिमी) बेवेल-साइड अप के साथ और थोड़ा 15-20 डिग्री पर angled.
  8. चार सप्ताह की कुल के लिए एक सप्ताह में दो बार चूहों इंजेक्शन प्रत्येक माउस आठ इंजेक्शन की कुल प्राप्त होगा.
    नोट: पिछले इंजेक्शन के बाद दो सप्ताह, इलाज चूहों MTD2 चूहों से oncogenic hepatocytes के ISPL टीका के लिए तैयार हैं.

2. लाइन MTD2 चूहों से टैग ट्रांसजेनिक Hepatocytes अलग करना

नोट: समाधान व्यंजनों के लिए तालिका 1 देखें।

10x अर्ल के संतुलित नमक समाधान Ca या Mg के बिना (ईबीएसकेएस बिना Ca या Mg) 4 ग्राम केसीएल
68 ग्राम नाक्कर
1.4 जी NaH2PO4] H2O
10 ग्राम डेक्सट्रोज
1 लीटर में पानी जोड़ें, पीएच 4.32 करने के लिए
फ़िल्टर के माध्यम से पास करें
समाधान 1 20 एमएल 10x ईबीएस बिना Ca या Mg
44 ग्राम नाहको3
1.33 एमएल 1.5 एम हेप्स
10 एमएल EGTA के 10 एमएल
200 एमएल में पानी जोड़ें
समाधान 2 100 एमएल 10x EBSS
2.2 जी नाHको3
6.67 एमएल 1.5 एम हेप्स
1 लीटर में पानी जोड़ें
0.75% कोलैनेस समाधान 15 मिलीग्राम कोलैजाइन प्रकार 1
20 एमएल का समाधान 2
पूरा मध्यम 2 आरपीएमआई
50 एमएल एफबीएस
5 एमएल 100x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन

तालिका 1: समाधान व्यंजनों.

  1. लाइन MTD2 चूहोंप्राप्त 38 oncogenic hepatocytes के स्रोत के रूप में सेवा करने के लिए.
  2. एनेस्थेटाइज 5-सप्ताह पुराने MTD2 चूहों का उपयोग कर 2.5% isoflurane.
    नोट: उचित एनेस्थेटाइजेशन को टो चुटकी विधि द्वारा जाँच की जाएगी। संक्षेप में, दो उंगलियों का उपयोग कर, माउस पैर की अंगुली / यदि कोई वापसी प्रतिक्रिया नहीं है, पशु काफी गहरी सर्जरी शुरू करने के लिए न्याय किया है.
  3. जब पर्याप्त रूप से बेहोश हो जाता है, तो चूहों को एक सुपाच्य स्थिति में रखें और पेट की सतह के पर्याप्त संपर्क प्रदान करने के लिए टेप के साथ हिस्सों को ठीक करें।
  4. एक midline laparotomy चीरा लाइना अल्बा की लंबाई के साथ कैंची का उपयोग कर पर्याप्त जिगर की एक पर्याप्त जोखिम प्रदान करने के लिए प्रदर्शन.
  5. जिगर और पोर्टल त्रय के बेहतर जोखिम प्रदान करने के लिए बाईं ओर आंतों विस्थापित.
  6. अवर वेना कैवा (आईवीसी) को बेनकाब करने के लिए जिगर के ऊपर विच्छेदन।
  7. एक धमनी दबाना का उपयोग कर जिगर के ऊपर आईवीसी लिगेट.
  8. जिगर की अवर सीमा पर लौटने, पोर्टल नस के लिए चतुर्थ पहुँच प्राप्त करने के लिए एक तितली सुई (सामग्री देखें) का उपयोग करें। हाथ से कैथेटर ठीक करें।
  9. क्रमिक रूप से 15 एमएल समाधान 1, 0.75% कोलैजानाज़ समाधान 2 के 15 एमएल और कैथेटर के माध्यम से समाधान 2 के 15 एमएल के साथ 8.9 एमएल/मिनट पर एक इंजेक्शन सिरिंज का उपयोग करके माउस लिवर को परफ्यूस करें।
  10. पीबीएस के 10-15 एमएल के साथ एक 50 एमएल शंकु ट्यूब में MTD2 चूहों से ट्यूमर द्रव्यमान काटने और लेने के द्वारा perfused जिगर फसल।
  11. पीबीएस निकालें और पीबीएस के साथ एक अतिरिक्त समय धो एंप्ल; इस कदम पर अपकेंद्रण मत करो.
  12. जिगर को कैंची से छोटे टुकड़ों में काटें और फिर शेष रक्त को हटाने के लिए पीबीएस 2x से फिर से धो लें।
  13. शंकु ट्यूब के लिए पूरा RPMI मध्यम के 5 एमएल जोड़ें और लगातार छोटे टुकड़े करने के लिए कैंची के साथ जिगर कीमा (और lt;3 मिमी) ऊतक आसानी से एक 5 एमएल पाइपेट के माध्यम से जाना चाहिए.
  14. 30 एमएल की एक अंतिम मात्रा में पूरा RPMI जोड़ें और एक 5 एमएल पिपेट का उपयोग कर जिगर निलंबित.
  15. मिश्रित विलयन को 70 डिग्री मीटर छलनी से 50 एमएल शंकु नली में फ़िल्टर करें।
  16. पूरी आरपीएमआई के साथ छलनी को कई बार धोएं और अतिरिक्त RPMI माध्यम जोड़कर अंतिम वॉल्यूम को 50 एमएल तक समायोजित करें।
  17. जल्दी से 500 आरपीएम की एक अधिकतम करने के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा निलंबन स्पिन; एक बार गति 50 x ग्रामकरने के लिए त्वरित है, अपकेंद्रित्र बंद कर दिया जाना चाहिए।
  18. सुपरनेंट को रद्द करें और पीबीएस के 20 एमएल में छर्रों को निलंबित करें।
  19. Trypan नीले बहिष्करण और एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना, तो निम्न कक्ष टीका के लिए 2.5 x 106/
    नोट: ट्यूमर ऊतक के 5 ग्राम से अपेक्षित उपज व्यवहार्यता के साथ 80 लाख hepatocytes है और 95%.

3. ISPL इंजेक्शन द्वारा जंगली प्रकार C57BL/6J चूहों के जिगर के लिए MTD2 चूहों से hepatocytes टीका

  1. aseptic तकनीक सभी प्रक्रियाओं में इस्तेमाल किया जाना चाहिए
  2. CCl4- इलाज पुरुष C57BL/6J चूहों के साथ anesthetize 2.5% आइसोफ्लुरेन, चूहों आंखों बाहर सुखाने से रोकने के लिए आंखों चिकनाई के साथ इलाज किया जाना चाहिए.
  3. इंजेक्शन के लिए हेपाटोसाइट्स के 200 $L के साथ सिरिंज तैयार करें।
  4. जब पर्याप्त रूप से बेहोश हो जाता है, बाईं ओर के साथ चूहों की स्थिति.
  5. चूहों के पूरे बाएं पार्श्व दाढ़ी, तो क्षेत्र साफ़, 70% शराब और betadine के बीच तीन बार बारी.
  6. शल्य चीरा से पहले कार्प्रोफेन उप-cutaneouly के 5 मिलीग्राम/
  7. रीढ़ की मांसपेशियों के ठीक नीचे पृष्ठीय चरम शुरुआत से 13वें रिब के समानांतर बाएं पार्श्व पर 1 सेमी चीरा बनाएं।
  8. तिल्ली की पहचान करें, फिर इसे कुंद-पॉइंटेड संदंश का उपयोग करके बाहरी करें।
  9. दो मध्यम आकार के टाइटेनियम क्लिप के साथ तिल्ली क्लिप. प्लीहा धमनी और नस के बीच दोनों क्लिप रखें, टीका लगाने के बाद बाद में कटौती करने के लिए क्लिप के बीच कमरे को छोड़ दें।
    नोट: लक्ष्य बोने के जोखिम को कम करने के लिए तिल्ली के अवर पोल को अलग करने के लिए है।
  10. 27 जी सुई का उपयोग करते हुए तिल्ली के अवर ध्रुव में तैयार हेपेटोसाइट्स के 200 $L (0.5 मिलियन) को इंजेक्ट करें।
  11. एक मध्यम आकार की क्लिप के साथ पेडिकल (निम्न स्प्लेनिक पोल वाहिकाओं) की अवर शाखा को क्लिप करें।
  12. शुरू में रखा दो क्लिप के बीच तिल्ली कट.
  13. प्लीहा के अवर ध्रुव को निकालें जो सीधे ट्यूमर कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किया गया था।
  14. आंतरिक मांसपेशी परत को बंद करने के लिए 3-0 पॉलीग्लैक्टिन 910 बाधित suturing का प्रयोग करें।
  15. बाहरी त्वचा की परत को बंद करने के लिए बाँझ स्टील घाव क्लिप का उपयोग करें।
    नोट: स्टील क्लिप टांके पर पसंद कर रहे हैं बाहर टांके चबाने जानवरों से बचने के लिए, एक दूरी घाव छोड़ने.
  16. सीवन के बाद 5 मिलीग्राम/किलोग्राम कार्प्रोफेन उपत्वचा के नीचे प्रशासन।
  17. एक तापमान नियंत्रित हीटिंग पैड पर सभी ठीक जानवरों प्लेस और बारीकी से निगरानी जब तक पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद.
  18. सर्जरी के बाद चूहों को पानी तक मुफ्त पहुंच दें। यदि माउस सर्जरी के दौरान निर्जलित हो जाता है, subcutaneous तरल पदार्थ प्रशासन (और lt;1 एमएल).
  19. 7-10 दिनों के बाद ऑपरेटिव पर त्वचा क्लिप निकालें.

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Representative Results

एजी-ट्रांसजेनिक चूहों से अलग किए गए ओंकोजेनिक हेपाटोसाइट्स (चित्र 2) को जंगली प्रकार के चूहों के यकृत में इंट्रा-स्प्लेनिक इंजेक्शन द्वारा बीजित किया गया था (चित्र 3)। प्रतिरोपित हेपैटोसाइट्स सफलतापूर्वक और विश्वसनीय रूप से वृद्धि हुई ऑर्थोटोपिक एचसीसी ट्यूमर ( चित्र 4 ) ट्यूमर विशिष्ट प्रतिजन एसवी40टीएजी के साथ (चित्र 5) यकृत ीय सूजन और फाइब्रोसिस की स्थापना में (चित्र 1) .

Figure 1
चित्र 1: HCC के माउस मॉडल तैयार करने के लिए Schematic| एचसीसी के एक अभिनव murine मॉडल की स्थापना के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन. C57BL/6J चूहों पहले CCl के आईपी इंजेक्शन के साथ इलाज कर रहे हैं4 चार सप्ताह के लिए दो बार साप्ताहिक जिगर फाइब्रोसिस प्रेरित करने के लिए. पिछले आईपी इंजेक्शन के बाद दो सप्ताह, CCl4-उपचार चूहों ISPL टीका के माध्यम से युवा पुरुष MTD2 चूहों से अलग hepatocytes प्राप्त करते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: लाइन MTD2 चूहों से हेपटोसाइट्स का अलगाव और शुद्धि। (क)एमटीडी2 चूहों से पृथक हेपाटोसाइट्स प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किए गए थे और कोशिका पृथक्केशन की व्यवहार्यता और शुद्धता का पता लगाने के लिए ट्राइपैन ब्लू से दागे गए थे।  बाएं पैनल सेल निष्कर्षण के दौरान अलग कर रहे हैं कि लिम्फोसाइटों (लाल तीर) दोनों hepatocytes (काला तीर) और ट्यूमर घुसपैठ से पता चलता है।  सही पैनल सेल आबादी कम गति centrifugation के बाद शेष से पता चलता है, hepatocytes (काला तीर) और काफी कम ट्यूमर लसीकाकोशिकाओं घुसपैठ सहित. आवर्धन - 10x अभिदृश्यक, स्केल बार - 100 डिग्री उ. (ठ) MTD2 चूहों से पृथक Hepatocytes जंगली प्रकार C57BL/6J चूहों के टीका लगाने से पहले trypan नीले समाधान के साथ दाग रहे हैं.  सेल अलगाव सफल होने के लिए निर्धारित किया जाता है अगर व्यवहार्यता है और 95%.  मृत कोशिकाओं trypan नीले (लाल तीर) के साथ दाग हो जाएगा, जबकि व्यवहार्य कोशिकाओं दाग नहीं किया जाएगा (काला तीर).  आवर्धन - 10x उद्देश्य, स्केल बार $ 100 उ। सही पर ग्राफ के साथ सेल अलगाव के परिणामसे पता चलता है gt; hepatocytes के 95% व्यवहार्य जा रहा है, सांख्यिकीय डेटा माइक्रोस्कोप के तहत 5 अलग मनाया क्षेत्र से आते हैं; त्रुटि सलाखों का प्रतिनिधित्व +एसडी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: जंगली प्रकार C57BL/6J चूहों के जिगर में hepatocytes के Intrasplenic टीका.  C57BL/6J चूहों में एचसीसी प्रेरित करने के लिए hepatocytes के ISPL टीका के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन. (1) तिल्ली की पहचान की है और बाहरी. (2) तिल्ली दो मध्यम आकार के टाइटेनियम क्लिप के साथ काटा जाता है। (3) तैयार हेपाटोसाइट्स तिल्ली के अवर ध्रुव में इंजेक्ट किए जाते हैं। (4) पेडिकल की अवर शाखा (निम्न प्लीहा ध्रुव वाहिकाओं) को एक मध्यम आकार की क्लिप से काटा जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: MTD2-hepatocytes के साथ टीका लगाने के बाद C57BL/6J चूहों में प्रगतिशील ट्यूमर विकास। (ए) हेपाटोकोशिकीय कार्सिनोमा (एचसीसी) ऑर्थोटोपिक ट्यूमर मॉडल प्रोटोकॉल के अनुसार स्थापित किया गया था। एक परमाणु छवियों टीका से पहले और उप अनुक्रमिक समय पाठ्यक्रम में लिया गया. (क) MTD2 hepatocytes के साथ टीका लगाने से पहले स्वस्थ जिगर दिखाता है. (ख) माउस जिगर 3 महीने के बाद सकल ट्यूमर के विकास के सबूत के साथ टीका. (ग) ट्यूमर के बढ़ते बोझ के साथ टीका लगाने के 3.5 महीने बाद। (घ) संरोपण के 4.5 माह बाद। (ड) यकृत में ट्यूमर के साक्ष्य के साथ टीका लगाए जाने के 6 महीने बाद। (ख)ट्यूमर नोड्यूल काटे गए थे और MTD2 hepatocytes के साथ टीका लगाने के बाद इंगित समय बिंदुओं पर तौला गया था।  त्रुटि पट्टियाँ + SD. **P.lt; 0.001 का प्रतिनिधित्व करती हैं, सांख्यिकीय विश्लेषण t-परीक्षणोंद्वारा किया गया था.  (ग)वाइल्डटाइप और एमटीडी2-इनोकेटेड लिवर वर्गों की प्रतिनिधि छवियां। हेमेटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला छद्म ग्रंथि गठन (काले तीर) को दर्शाया गया है। वहाँ परमाणु भीड़ है, और ट्यूमर कोशिकाओं उच्च नाभिक से साइटोप्लाज्म अनुपात (बढ़ी हुई छवि) के साथ eosinophilic हैं। आवर्धन - 20x उद्देश्य, स्केल बार - 50 डिग्री उ. ऊपरी दाईं ओर इनसेट को मैन्युअल रूप से बढ़ाया जाता है। (डी)सीरियस लाल धुंधला जो यकृत फाइब्रोसिस के अनुरूप असामान्य कोलेजन जमाव को दर्शाता है। आवर्धन: 40x उद्देश्य, स्केल बार $ 20 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र5: ट्यूमर में SV40 टी प्रतिजन जीन का विशिष्ट पता लगाने.  (एक) चूहों भर में ट्यूमर ऊतक और अतिरिक्त ऊतक के नमूने ट्यूमर स्थापित चूहों से एकत्र किए गए थे.  जीनोमिक डीएनए ऊतक और दोनों SV40 टी एजी और P53 (नियंत्रण) के लिए प्राइमर से अलग किया गया था पारंपरिक पीसीआर के लिए संश्लेषित थे. SV40 टी प्रतिजन जीन ट्यूमर ऊतक में पाया गया था, लेकिन या तो सामान्य ऊतक या चूहों में अन्य ऊतक में मौजूद नहीं है. (बी) ट्यूमर धारी चूहों से ट्यूमर ऊतक एकत्र किया गया था और विरोधी SV40 टी प्रतिजन एंटीबॉडी के साथ दाग. वाम पैनल स्वस्थ जिगर भोले चूहों से एकत्र ऊतक से एक नकारात्मक नियंत्रण है.  दाएँ पैनल ट्यूमर असर चूहों (भूरे रंग) से एकत्र ट्यूमर ऊतक के महत्वपूर्ण SV40 टी प्रतिजन धुंधला से पता चलता है.  आवर्धन - 40x अभिदृश्यक, स्केल बार - 20 उ. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के साथ, हम मानव एचसीसी दीक्षा और प्रगति mimics कि एचसीसी के एक विश्वसनीय और reproduible murine मॉडल की स्थापना की है. चिकित्सकीय, कई जोखिम कारक लगातार जिगर की चोट, जिगर फाइब्रोसिस, सिरोसिस और एचसीसी के अंतिम चरण को प्रेरित करते हैं। हमारे प्रोटोकॉल में, सीसीएल4 के आईपी इंजेक्शन का उपयोग पहले जंगली प्रकार के चूहों में यकृत फाइब्रोसिस का उत्पादन करने के लिए किया जाता है, जो बाद में ऑनकोजेनिक हेपाटोसाइट्स को यकृत फाइब्रोसिस की सेटिंग में ट्यूमर बनाने की अनुमति देता है। हमने पाया है कि ट्यूमर गठन चूहों कि CCl4 उपचार के दो सप्ताह बाद hepatocyte टीका प्राप्त में सबसे सफलतापूर्वक हुई, चूहों अन्य समय बिंदुओं पर इंजेक्शन प्राप्त करने की तुलना में. इसके अलावा, हमने पाया कि सीसीएल4 इंजेक्शन के बाद चार महीने तक लिवर फाइब्रोसिस का पता लगाया जा सकता है। इस दृष्टिकोण से अधिक में परिणाम 90% चूहों के HCC ट्यूमर विकसित करने के लिए CCl4के लिए जोखिम के बिना चूहों की तुलना में . हमारे मॉडल में, hepatocytes लाइन MTD2 चूहों से C57BL/6J चूहों में स्थानांतरित, जिगर के लिए यातायात जहां वे hepatocytes के रूप में शामिल हो जाते हैं कि एक ऊतक प्रतिजन के रूप में TAg व्यक्त. MTD2 से hepatocytes के अलगाव इस प्रोटोकॉल के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम है. MTD2 माउस जिगर पूरी तरह से जिगर के भीतर घूम लाल रक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए समाधान 1 और 2 के साथ अच्छी तरह से perfused हैं. कोलैडेज समाधान संकेत एकाग्रता और उचित जिगर पाचन उत्पन्न करने के लिए hepatocytes जारी करने के लिए गति पर जिगर perfuse करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कोलैडेंस की कम सांद्रता का उपयोग पाचन के लिए अपर्याप्त है, जिसके परिणामस्वरूप हेपेटोसाइट्स के झुरमुट होते हैं। इसके विपरीत, उच्च सांद्रता ऊतक पर भी कठोर हैं, व्यवहार्य hepatocytes की एक महत्वपूर्ण कमी में जिसके परिणामस्वरूप. हम यह भी पाते हैं कि संक्षिप्त centrifugation के रूप में हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित करने के लिए hepatocytes की शुद्धता में सुधार की आवश्यकता है. कम स्पिन हम centrifugation के लिए इस्तेमाल किया hepatocytes वेग और कोशिकाओं के इन दो प्रकार के घनत्व के अंतर के आधार पर supernatant में ल्यूकोसाइट्स छोड़ सकते हैं.

अगले महत्वपूर्ण कदम जंगली प्रकार चूहों में hepatocytes टीका लगाने के लिए मार्ग है. हमारे पायलट अध्ययन में, हम hepatocyte टीका का संचालन करने के लिए विभिन्न तरीकों का पता लगाया. जिगर में सफल ऑर्थोटोपिक ट्यूमर विकास माउस प्रति आधा एक लाख कोशिकाओं की एक खुराक पर oncogenic hepatocytes के intrasplenic टीका प्राप्त चूहों में सबसे अच्छा देखा जाता है, पूंछ नस और intraperitoneal के माध्यम से प्रशासित कोशिकाओं को प्राप्त करने की तुलना में चूहों विभिन्न खुराक पर इंजेक्शन. इन निष्कर्षों से पता चलता है कि ऑर्थोटोपिक एचसीसी वृद्धि मार्ग और खुराक पर निर्भर है। घातक परिवर्तन धीरे-धीरे होता है और पूरे यकृत पैरेन्काइमा के बजाय प्रत्यारोपित हेपाटोसाइट्स की उप-जनसंख्या तक सीमित है। जारी सेल प्रसार परिणाम ट्यूमर नोड्यूल जिगर भर में विकसित करने में.

एचसीसी या अन्य कैंसर के लिए प्रगति के लिए यह प्रतिरक्षा प्रणाली से बचना चाहिए; वास्तव में, प्रतिरक्षा विनाश से बचने अब कैंसर39की एक पहचान माना जाता है. हालांकि, ट्यूमर-विशिष्ट प्रतिजन की कमी अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा है। हमारे मॉडल में, TAg ट्यूमर में व्यक्त किया जाता है, नहीं अन्य अंगों, जो एक ट्यूमर विशेष प्रतिजन के रूप में कार्य करता है. इसके अलावा, TAg कई अच्छी तरह से परिभाषित epitopes कि C57BL/6J चूहों में CD8 टी कोशिकाओं द्वारा पहचाना जा सकता है. तग एपिटो-I के संबंध में, हमने 416 चूहों को लाइन उत्पन्न की है जो इस एपिटोप34के लिए ट्रांसजेनेली एक्सटेंसिंग टी सेल रिसेप्टर्स को व्यक्त करते हैं। ट्यूमर एंटीजन-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए TAg को लक्षित करने से हमें ट्यूमर दीक्षा और प्रगति के दौरान ट्यूमर प्रतिरक्षा निगरानी की जांच करने की अनुमति देता है, जो डीईएन या आनुवंशिक हेरफेर द्वारा प्रेरित मॉडल का उपयोग करना संभव नहीं है। अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने से हम महत्वपूर्ण कोशिकाओं और ट्यूमर प्रेरित प्रतिरक्षा सहिष्णुता के बीच वाले अणुओं की पहचान कर सकते हैं। इन प्रमुख कारकों को लक्षित करने से एचसीसी के खिलाफ अभिनव इम्यूनोथैरेपी रणनीतियों के हमारे विकास को काफी आगे बढ़ सकता है। इस अनूठी एचसीसी मॉडल और स्थापित उपकरणों का उपयोग करना, हम ट्यूमर प्रेरित सहिष्णुताअंतर्निहिततंत्र की जांच की है 25,35 और विभिन्न प्रतिरक्षा आधारित antitumor इम्यूनोथेरपी31,32 का पता लगाया , 36 , 37.

संक्षेप में, एचसीसी के हमारे स्थापित murine मॉडल मानव रोग के कुछ विशिष्ट विशेषताओं को दर्शाता है. हमारे पहले प्रकाशित लेख में, हम एक चिकित्सकीय प्रासंगिक ट्यूमर मॉडल है कि मानव एचसीसी की विशिष्ट विशेषताएं थी के रूप में यह स्थापित करने में सक्षम थे. हमने दिखाया कि चूहों CCl4 और MTD2 hepatocytes के साथ इलाज ट्यूमर है कि HCC संबद्ध प्रतिजनों व्यक्त विकसित, एएफपी और GPC336. पैथोलॉजी ने निर्धारित किया कि हमारे मौरी मॉडल में घाव मानव एचसीसी के लिए मैक्रोस्कोपी और पैथोलॉजिकल दोनों समान हैं। इस विश्वसनीय मॉडल और विकसित उपकरणों का लाभ उठाते हुए, हम एचसीसी विकास और चिकित्सकीय रूप से उपलब्ध उपचार के तंत्र में अंतर्दृष्टि सहित इस जटिल मानव रोग का अध्ययन कर सकते हैं।

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Disclosures

घोषणा करने के लिए कोई नहीं है।

Acknowledgments

यह काम NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O'Carroll, PI) और NIH/NCI R01CA208396 (मार्क केस्टर, गुआंग्फू ली, केविन एफ Staveley-O'Carroll) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia machine VETEQUIP IMPAC6 anesthesia machine for surgery
Butterfly needle BD 8122963 Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice Jackson Lab 000664  mice used in prototol
Carprofen CRESCENT CHEMICAL 20402 carprofen for pain release
Cell Strainer  CORNING REF 431751 Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-30R centrifuge for cell isolation
Clips  Teleflex Medical REF 523700 Titanium Clips for spleen
Microscope Zeiss Primovert  microscope for cell observation
Mtd2 mice N/A Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle BD REF 305109 BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture ETHICON J303H coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody Abcam ab16879 anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe BD REF 309626 1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue SIGMA T 8154 Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips Reflex reflex9, Part. No. 201-1000 stainless steel wound clips for wound close

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कैंसर अनुसंधान अंक 151 hepatocellular कैंसर ट्यूमर मॉडल माउस murine मॉडल जिगर फाइब्रोसिस कैंसर
हेपेटोकोशिक सूजन और फाइब्रोसिस की स्थापना में उत्पन्न होने वाले हेपैटोकोशिक कैंसर के एक ओंकोजेनिक हेप्टोसाइट-प्रेरित ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल
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Qi, X., Schepers, E., Avella, D., Kimchi, E. T., Kaifi, J. T., Staveley-O'Carroll, K. F., Li, G. An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis. J. Vis. Exp. (151), e59368, doi:10.3791/59368 (2019).

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