Summary
여기서, 간세포암(HCC)의 전형적인 면역 특징을 재기하는 간암의 임상적으로 관련 있는 뮤린 모델의 개발을 설명한다.
Abstract
간세포암(HCC)의 전형적인 면역 특성을 다루는 임상적으로 관련된 동물 모델의 부재는 근본적인 메커니즘의 해명과 혁신적인 면역 치료 전략의 개발을 크게 저해했습니다. 인간 HCC를 재량화하는 이상적인 동물 모델을 개발하기 위해, 면역 적격 남성 C57BL/6J 마우스는 먼저 간 섬유증을 유도하기 위해 탄소 사염화물 (CCl4)주사를 받은 다음 젊은 남성으로부터 조직학적으로 정상 인간 세포체를 받습니다. SV40 T 항원 (TAg)-형질전환 마우스 (MTD2) 인트라 비장 (ISPL) 접종에 의해. 사춘기에 수용자 남성 마우스에서 생성 된 안 드로 겐 간 특이적 프로모터의 제어 하에 TAg 발현을 시작. 결과적으로, 전송된 간세포는 암세포가 되고 간 섬유증/간경변의 조정에 있는 종양 질량을 형성합니다. 이 새로운 모델은 간 섬유증/간경변의 맥락에서 인간 HCC 개시 및 진행을 모방하고 면역 기능 장애를 포함하여 인간 HCC의 가장 전형적인 특징을 반영합니다.
Introduction
간세포암(HCC)은 미국에서 가장 빠르게 증가하는 유형의 암(미국)1,2,3. 매년 약 850,000개의 새로운 사례가4,5 및 700,000명의 환자가 이 치명적인질병으로6, 7,8,9,10으로 진단됩니다. 전 세계적으로 암 관련 사망의 두 번째로 높은 원인입니다. HCC의 관리는 외과적 절제술, 이식, 절제, 화학색전증, 또는소라페닙(sorafenib) 과같은 전신 요법을 포함한다. 외과 절제술 또는 이식으로 조기 진단 및 관리는 전체 생존 율이 가장 높은4. 불행하게도, 환자의 대다수는 나중 단계에서 나타나고 절제, 화학색전증 또는 sorafenib12를가진 관리를 요구합니다. 소라페닙, 수용 체 티로신 키 나 제 억제제 (RTKI), 에 식품 의약품 안전 청에 의해 승인 되었다 2008 절제 할 수 없는 HCC 치료에 사용할 수 있는 유일한 전신 약물 치료로. 약물은 전체 생존율이 7.9개월에서10.7개월13개월로소폭 증가하지만, HCC 관리에 활용될 수 있는 새로운 치료 전략을 제공했다.
확립된 암을 제거하기 위해 면역체계를 조작하는 것은 암 연구에서 급속히 성장하고 있는 분야이다14. 면역 검사점 연구는 암 치료15,16에서면역 치료 약물 개발을 상당히 진전하였다. FDA는 세포독성 T-림프구 항원 4(CTLA-4), 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1), 흑색종, 폐암, 두경부암 및 방광암 치료를 위한 리간드 PD-L1에 대한 항체(Abs) 사용을승인했다. 18세 , 19세 , 20.진행 중인 HCC의 치료를 위해 PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4에 대하여 하나 또는 다중 항체를 이용한 단독요법 또는 병용 요법의 임상 시험이 진행 중이다21,22,23,일부 시험은 유리한 결과를 보여 주었다. 2017년, FDA는 소아페닙에 대한 내성이 있는 HCC 환자를 치료하기 위해 항 PD-1 항체에 대한 조기 승인을 승인했지만, 이 치료법의 전반적인 반응률은 14.3%에 불과합니다. 다른 전략은 이 때 임상 실습으로 번역되지 않았습니다24,25. 면역체크체크치료개선을위한종양유발심오한면역내성을극복26; 면역 체크포인트 치료의 효능을 예측; 면역 관련 부작용 방지; 최적화 관리 경로, 복용량, 그리고 주파수; 그리고 치료의 효과적인 조합을 찾는27,28,29 모두 매우 어려운 작업 남아있다.
현재 마우스 모델에서 HCC를 유도하는 데 사용되는 몇 가지 통상적인 접근법이 있으며, 조사자의 특정 연구 질문30에따라 활용되고 있다. 화학적으로 유도된 HCC 마우스 모델은 유해성 화합물을 가지고 상해 유발 악성을 모방한다. HCC 세포주의 자궁외 또는 직교 이식을 통한 이종이식 모델은 약물 스크리닝에 적합합니다. 많은 유전자 변형 마우스가 HCC의 병리생리학을 조사하도록 설계되었습니다. 바이러스 성 유전자를 발현 하는 형질 전환 마우스, 종양 유전자 및 성장 인자 간 암 선 에서 관련 된 경로의 식별을 허용. 본래의 한계로 인해, 이러한 모델은 인간 HCC에서 볼 수 있는 전형적인 면역 특성을 되풀이하지 않으며, 이는 근본적인 메커니즘의 해명과 혁신적인 면역 치료 전략의 개발을 크게 저해했습니다14 ,15. 우리는 최근에 임상적으로 관련있는 뮤린 모형을 만들었습니다. 이 새로운 모델은 인간 HCC 개시 및 진행을 모방할 뿐만 아니라 면역 기능 장애를 포함한 인간 질병의 가장 전형적인 특징을 반영합니다. 우리는 그것의 생물학적 및 면역학적 특성을 특징으로 합니다. 이 새로운 모델을 활용하여 HCC31, 32,33,34,35,36을치료하기 위한 다양한 면역 치료 전략을 탐구했습니다. 37. 이 독특한 플랫폼은 종양 유발 면역 내성의 메커니즘을 연구하고 최종 임상 번역을 향한 HCC에 대한 개념 증명 치료 전략을 개발할 수 있게 합니다.
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Protocol
참고: 동물 과목을 포함한 모든 절차는 미주리 대학의 IACUC에 의해 승인되었습니다. 모든 마우스는 "실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드"에 설명 된 기준에 따라 인도적 치료를 받았다. 세포 격리 및 예방 접종에 대한 다음 절차는 후드에서 수행해야합니다. 모든 연주자는 마우스와 조직을 처리하기 위한 표준 개인 보호 장비를 착용해야 합니다.
1. 탄소 사염화물의 IP 주입으로 간 섬유증 과 간경변의 유도 (CCl4)
참고: 그림 1을 참조하십시오. (CCl4는 매우 위험한 시약이며, 내화학성 장갑을 착용하여 신중하게 취급해야 합니다.)
- 6~8주 된 수컷 C57BL/6J 마우스를 구하십시오(재료 표참조).
- 원심분리기 튜브에 옥수수 오일에 10% CCl4 (v/v) 용액을 준비합니다. 주입할 마우스의 수를 기준으로 총 부피를 결정합니다(단계 1.6 참조).
- 적절한 마우스 처리 기술을 사용하여 주사를 위해 하나의 마우스를 선택합니다.
- 등쪽(복부) 측면을 위로 올려 마우스를 수동으로 제지합니다.
- 70 % 알코올로 문질러 마우스의 복벽에 주사 부위를 청소합니다.
- 25 게이지 일회용 바늘을 사용하여 복강 내 (IP) 주입으로 10 % CCl4 용액의 160 μL로 남성 C57BL / 6J 마우스를 주입하십시오.
- 바늘이 경사면을 위로 올리고 15-20도에서 약간 기울어진 복벽 (약 4-5mm)을 통해 침투하도록하십시오.
- 총 4주 동안 일주일에 두 번 마우스를 주사-각 마우스는 총 8회 주사를 받게 된다.
참고: 마지막 주사 후 2주, 처리된 마우스는 MTD2 마우스로부터의 종인 성 간세포의 ISPL 접종을 위해 준비되었다.
2. 라인 MTD2 마우스에서 태그 형질 전환 간세포 분리
참고: 솔루션 레시피는 표 1을 참조하십시오.
| Ca 또는 Mg가 없는 10x 얼의 균형 잡힌 소금 용액(Ca 또는 Mg이 없는 EBSS) | KCl 4 g 68 g 나클 1.4 g NaH2PO4· 물 덱스트로스 10 g 1리터, pH에 4.32에 물을 추가 필터 통과 |
| 솔루션 1 | Ca 또는 Mg가 없는 20 mL 10x EBSS 44 g 나코3 1.33 mL 1.5M 헤페 10 mL 의 10 mL EGTA 200 mL에 물을 추가 |
| 솔루션 2 | 100 mL 10x EBSS 2.2 g NaHCO3 6.67 mL 1.5 M 헤페 1리터에 물을 추가합니다. |
| 0.75% 콜라게나아제 용액 | 콜라게나아제 15 mg 용액 20 mL |
| 전체 매체 | 2 RPMI 50 mL FBS 5 mL 100x 페니실린-스트렙토마이신 |
표 1: 솔루션 레시피.
- 종인 성 간세포의 공급원으로 작용하기 위해 라인 MTD2마우스(38)를 구한다.
- 2.5% 이소플루란을 사용하여 5주령 MTD2 마우스를 마취시.
참고 : 적절한 마취는 발가락 핀치 방법으로 검사됩니다. 간단히 말해서, 두 손가락을 사용하여 마우스 발가락 / 발을 잘 짜내줍니다. 철수 반응이 없는 경우, 동물은 수술을 시작할 만큼 충분히 깊은 것으로 판단됩니다. - 적당히 진정되면 마우스를 척추 위치에 놓고 복부 표면의 적절한 노출을 제공하기 위해 테이프로 사지를 고정하십시오.
- 간장의 적절한 노출을 제공하기에 충분히 큰 리냐 알바의 길이를 따라 가위를 사용하여 중간 선 개복절을 수행합니다.
- 간과 포털 트라이어드의 더 나은 노출을 제공하기 위해 왼쪽으로 내장을 대체합니다.
- 열등한 정맥카바(IVC)를 노출시키기 위해 간 위를 해부한다.
- 동맥 클램프를 사용하여 간 위의 IVC를 리게이트합니다.
- 간 경계의 열등한 국경으로 돌아가서 나비 바늘 (자료 참조)을 사용하여 포털 정맥에 IV 액세스 권한을 얻습니다. 손으로 카테터를 고정하십시오.
- 연속적으로 8.9 mL /min에서 주사 주사기를 사용하여 마우스 간을 침전시키고 15 mL의 용액 1, 0.75 % 콜라게 나아제 용액 2 의 15 mL, 카테터를 통해 용액 2의 15 mL.
- PBS의 10-15 mL를 가진 50 mL 원추형 관에 MTD2 마우스에서 종양 질량을 절단하고 취하여 관류간을 수확하십시오.
- PBS를 제거하고 PBS로 추가 시간을 세척; 이 단계에서 원심분리기를 사용하지 마십시오.
- 가위를 사용하여 작은 조각으로 간을 잘라 다음 남은 혈액을 제거하기 위해 PBS 2x로 다시 씻어.
- 원뿔형 튜브에 5 mL의 완전한 RPMI 배지를 추가하고 가위로 간을 작은 조각 (&3 mm)에 지속적으로 다진 - 조직은 5 mL 파이펫을 원활하게 통과해야합니다.
- 최종 부피에 완전한 RPMI를 추가하고 5 mL 파이펫을 사용하여 간을 일시 중단하십시오.
- 혼합 용액을 70 μm 스트레이너로 50 mL 원엽 튜브로 필터링합니다.
- 완전한 RPMI로 스트레이너를 여러 번 세척하고 RPMI 배지를 추가하여 최종 부피를 50 mL로 조정합니다.
- 원심분리기로 서스펜션을 최대 500rpm까지 빠르게 회전시다. 속도가 50 x g로가속되면 원심 분리기를 중지해야합니다.
- PBS의 20 mL에서 상류및 펠릿을 중단한다.
- Trypan 청색 배제 및 혈세포계를 사용하여 세포를 카운트한 다음, 다음세포 접종을 위해 세포 농도를 2.5 x 10 6/mL로 조정한다.
참고 : 종양 조직의 5 그램에서 예상 수율은 생존율 >95 %를 가진 8천만 개의 간세포입니다.
3. ISPL 주입에 의하여 야생 형 C57BL/6J 마우스의 간으로 MTD2 마우스에서 간세포를 접종
- 무균 기술은 모든 절차에 사용되어야한다
- CCl 4-처리된수컷 C57BL/6J 마우스를 2.5% 이소플루란으로 마취시키고, 마우스는 눈이 마르지 않도록 눈윤을 치료해야 한다.
- 주사를 위해 간세포의 200 μL로 주사기를 준비하십시오.
- 적당히 진정되면 마우스를 왼쪽 위로 배치합니다.
- 마우스의 왼쪽 측면 전체를 면도한 다음 70% 알코올과 베타딘을 세 번 번 갈아입어 부위를 문질러 냅니다.
- 관리 5 카프로펜의 mg/kg 의 피하 수술 절개 전에.
- 왼쪽 측면에 1cm 절개를 하여 척추 근육 바로 아래에서 등쪽 의 극단적 인 시작에서 13번째 갈비뼈와 평행하게 합니다.
- 비장을 식별한 다음 무딘 뾰족한 집게를 사용하여 외부로 바뚝을 바타게 합니다.
- 중간 크기의 티타늄 클립 두 개로 비장을 잘라냅니다. 비장 동맥과 정맥 사이에 두 클립을 놓고 접종 후 나중에 자르기 위해 클립 사이에 공간을 둡니다.
참고: 목표는 비장의 열등한 기둥을 분리하여 시드 위험을 줄이는 것입니다. - 27 G 바늘을 사용하여 비장의 열등한 기둥에 제조된 간세포의 200 μL(0.5백만)을 주입한다.
- 페디클의 열등한 가지(열등한 비장 극 혈관)를 중간 크기의 클립 하나로 잘라냅니다.
- 처음에 배치된 두 클립 사이에 비장을 잘라냅니다.
- 종양 세포로 직접 주입한 비장의 열등한 기둥을 제거합니다.
- 3-0 폴리글락틴(910)을 사용하여 내부 근육층을 닫아 개질을 방해하였다.
- 멸균 된 강철 상처 클립을 사용하여 외부 피부 층을 닫습니다.
참고: 스틸 클립은 동물이 봉합사를 피하고 갈라진 상처를 남기지 않도록 봉합사보다 선호됩니다. - 관리 5 카프로펜의 mg/kg 의 피하 봉합사 후.
- 모든 회복 동물을 온도 제어 가열 패드에 놓고 마취에서 완전히 회복될 때까지 면밀히 모니터링하십시오.
- 수술 후 마우스에게 물을 무료로 이용할 수 있도록 하십시오. 마우스가 수술 중에 탈수되면 피하 유체 (&1 mL)를 투여하십시오.
- 수술 후 7-10일 동안 피부 클립을 제거하십시오.
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Representative Results
TAg-형질전환 마우스로부터 분리된 종인성 간세포(도2)를비장 내 주사에 의해 야생형 마우스의 간에서 파종하였다(도3). 이식된 간세포는 종양 특이적 항원 SV40 TAg(도 5)와 함께 정형암 HCC 종양을 성공적으로 안정적으로 성장시키고 간염증 및 섬유증의 설정에서 성장하였다(도1).
그림 1: HCC의 마우스 모델을 준비하기 위한 회로도. HCC의 혁신적인 뮤린 모델을 확립하기 위한 실험적인 디자인. C57BL/6J 마우스는 간 섬유증을 유도하기 위하여 4 주 동안 매주 두 번 CCl4의 IP 주입으로 처음으로 취급됩니다. 마지막 IP 주입 후 2주,CCl 4-처리된 마우스는 ISPL 접종을 통해 젊은 남성 MTD2 마우스로부터 분리된 간세포를 받는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 라인 MTD2 마우스로부터 간세포의 분리 및 정제. (a)MTD2 마우스로부터 분리된 간세포를 프로토콜에 따라 제조하고 세포 단레이션의 생존가능성 및 순도를 검출하기 위해 트리판 블루로 염색하였다. 좌측 패널은 세포 추출 중에 단리된 간세포(검정 화살표)와 종양 침투 림프구(빨간색 화살표)를 모두 나타낸다. 오른쪽 패널은 간세포 (검은 색 화살표)와 림프구침투 종양이 현저히 적은 것을 포함하여 저속 원심 분리 후 남아있는 세포 집단을 보여줍니다. 배율 = 10x 객관적, 스케일 바 = 100 μm.(B)MTD2 마우스로부터 분리된 간세포는 야생형 C57BL/6J 마우스의 접종 전에 트라이판 블루 용액으로 염색된다. 세포 격리는 생존가능성이 >95%인 경우 성공으로 결정됩니다. 죽은 세포는 트라이판 블루 (빨간색 화살표)로 염색되고, 생존 가능한 세포는 염색되지 않습니다 (검은 색 화살표). 배율 = 10배 목표, 축척 막대 = 100 μm. 오른쪽 그래프는 간세포의 95%가 실행 가능한 세포 격리 의 결과를 보여 주며, 통계 데이터는 현미경하에서 5 개의 다른 관찰 된 분야에서 나옵니다. 오류 막대는 +SD를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 야생 형 C57BL/6J 마우스의 간으로 간 세포의 내 증 문헌. C57BL/6J 마우스에서 HCC를 유도하는 간세포의 ISPL 접종을 위한 실험 설계. (1) 비장을 식별하고 외부화합니다. (2) 비장 두 개의 중간 크기의 티타늄 클립으로 클리핑됩니다. (3) 준비된 간세포는 비장의 열등한 기둥에 주입된다. (4) 페디클의 열등한 가지 (열등한 비장 극 혈관)는 하나의 중간 크기의 클립으로 잘립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: MTD2-간세포로 접종한 후 C57BL/6J 마우스에서 진행성 종양 개발. (a)간세포암(HCC) 정형종양 모델이 프로토콜에 따라 확립되었다. 해부학 적 이미지는 접종 전에 및 하위 순차적 시간 과정에서 촬영되었습니다. (a) MTD2 간세포로 접종하기 전에 건강한 간을 나타낸다. (b) 마우스 간 3 개월 총 종양 발달의 증거와 접종 후. (c) 종양 부담이 증가하는 접종 후 3.5 개월. (d) 접종 후 4.5 개월. (e) 간 전체에 걸쳐 종양의 증거와 접종 후 6 개월. (B)종양 소두를 MTD2 간세포로 접종한 후 지시된 시점에서 수확및 칭량하였다. 오차 막대는 +SD를 나타낸다. ***P < 0.001, 통계 분석은 t-test에의해 수행되었다. (C)야생형 및 MTD2 접종 간 절의 대표적인 이미지. 헤마톡실린과 에오신 (H&E) 염색은 가짜 의 형성 (검은 색 화살표)을 묘사한다. 핵 군집이 있고, 종양 세포는 높은 핵 대 세포질 비율 (확대된 심상)을 가진 호산구성입니다. 배율 = 20배 목표, 축척 막대 = 50 μm. 오른쪽 상단의 인셋은 수동으로 증폭됩니다. (D)시리우스 붉은 얼룩은 비정상적인 콜라겐 증착을 나타내며, 간 섬유증과 일치한다. 배율: 40x 목표, 축척 막대 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 종양에서 SV40 T 항원 유전자의 특이적 검출. (a)종양 조직 및 마우스 전체에 걸쳐 추가적인 조직 샘플을 종양 확립 마우스로부터 수집하였다. 게놈 DNA는 SV40 T Ag 및 P53(대조군)에 대한 조직 및 프라이머로부터 분리되었고, 종래의 PCR을 위해 합성되었다. SV40 T 항원 유전자는 종양 조직에서 검출되었지만 마우스의 정상 조직 또는 다른 조직에는 존재하지 않는다. (B)종양 조직을 종양 지지 마우스로부터 채취하고 항-SV40 T 항원 항체로 염색하였다. 좌측 패널은 순진한 마우스로부터 수집된 건강한 간 조직에서 음성 대조군이다. 오른쪽 패널은 종양 베어링 마우스로부터 수집된 종양 조직의 유의한 SV40 T 항원 염색을 나타낸다(갈색). 배율 = 40x 목표, 축척 막대 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜을 통해 우리는 인간 HCC 개시 및 진행을 모방하는 HCC의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 뮤린 모델을 확립했습니다. 임상적으로, 많은 위험 요소는 연속적으로 간 손상을 유도, 간 섬유증, 간경변과 HCC의 최종 단계. 우리의 프로토콜에서, CCl4의 IP 주입은 먼저 야생 형 마우스에서 간 섬유증을 생산하는 데 사용되며, 이는 후속 종양 발생 간 세포가 간 섬유증의 설정에서 종양을 형성 할 수 있게합니다. 우리는 종양 대형이 CCl4 처리 후에 2 주 후에 간세포 접종을 수신한 마우스에서 가장 성공적으로 일어났다는 것을 것을을 발견했습니다, 그밖 시간 점에 주사를 수신하는 마우스에 비해. 또한, 우리는 간 섬유증이 CCl4 주입 후에 4 달까지 검출될 수 있다는 것을 것을을 발견했습니다. 이 접근은 CCl 4에 노출 없이 마우스에 비교된 HCC 종양을 개발하는 마우스의 90% 이상 에서유래합니다. 우리의 모형에서, 간세포는 C57BL/6J 마우스로 선 MTD2 마우스에서 전송되고, 조직 항원으로 TAg를 표현하는 간세포로 통합되는 간으로 트래픽. MTD2에서 간세포의 분리는 이 프로토콜 동안 중요한 단계입니다. MTD2 마우스 간은 완전히 간 내순환 적혈구를 제거하기 위해 용액 1 과 2와 철저하게 관열된다. 콜라게나아제 용액은 지시된 농도와 속도로 간을 침투하여 간세포가 방출되는 적절한 간 소화를 생성하는 데 사용됩니다. 콜라게나아제의 농도가 낮아지는 것은 소화에 충분하지 않아 간세포가 덩어리로 생성됩니다. 대조적으로, 고농도는 조직에 너무 가혹하여 실행 가능한 간세포의 상당한 감소를 초래합니다. 우리는 또한 우리의 프로토콜에 기술된 바와 같이 간단한 원심분리가 간세포의 순도를 향상시키기 위해 필요하다는 것을 발견한다. 원심분리에 사용되는 낮은 스핀은 간세포를 침전시키고 이 두 가지 유형의 세포의 밀도 차이에 따라 상복부에 백혈구를 남길 수 있습니다.
다음 중요한 단계는 야생 형 마우스로 간세포를 접종하기위한 경로입니다. 파일럿 연구에서 우리는 간세포 접종을 수행하는 다양한 방법을 탐구했습니다. 간에서 성공적인 정형외 종양 성장은 꼬리 정맥과 복강 내 정맥을 통해 투여 된 쥐에 비해 마우스 당 반 만 세포의 용량으로 종양 발생 간 세포의 경내 접종을받는 마우스에서 가장 잘 볼 수 있습니다. 다양한 용량으로 주사. 이러한 사실 인정은 정형고토피 HCC 성장이 경로 및 용량 의존적이라는 것을 시사한다. 악성 형형은 점차적으로 발생하며 전체 간 실질이 아닌 이식 된 간세포의 하위 집단으로 제한됩니다. 지속적인된 세포 증식 결과 간 을 통해 개발 종양 작은 혹.
HCC 또는 다른 암진행을 위해 면역 계통을 회피해야 합니다; 사실, 면역 파괴를 피하는 것은 지금 암39의특징으로 간주됩니다. 그러나, 종양 특정 항원의 부족은 근본적인 기계장치를 해명에 중요한 방벽입니다. 우리의 모형에서, TAg는 종양 특정 항원으로 작용하는 그밖 기관이 아닌 종양에서 표현됩니다. 또한, TAg는 C57BL/6J 마우스에서 CD8 T 세포에 의해 인식될 수 있는 수많은 잘 정의된 에피토프를 가지고 있다. TAg 에피토프-I에 관하여, 우리는 이 에피토프34를위한 T 세포 수용체를 형질적으로 발현하는 선 416 마우스를 생성했습니다. 종양 항원 특이적 면역 반응을 검사하기 위해 TAg를 표적으로 하는 것은 DEN 또는 유전자 조작에 의해 유도된 모델을 사용하여 불가능한 종양 개시 및 진행 동안 종양 면역 감시를 조사할 수 있게 한다. 근본적인 기계장치를 설명하면 종양 유발 면역 내성을 중재하는 중요한 세포 및 분자를 식별할 수 있습니다. 이러한 주요 요인을 표적으로 하는 것은 HCC에 대하여 혁신적인 면역 치료 전략의 우리의 발달을 현저하게 진전시킬 수 있습니다. 이 독특한 HCC 모형 및 확립한 공구를 사용하여, 우리는 종양 유도한 내성25,35의 근본적인 기계장치를 조사하고 각종 면역 기지를 둔 항종양 면역 요법31,32를 탐구했습니다 , 36세 , 37.
요약하자면, HCC의 확립된 뮤린 모델은 인간 질병의 몇 가지 전형적인 특징을 반영합니다. 우리의 이전에 간행된 기사에서, 우리는 인간 HCC의 전형적인 특징이 있던 임상으로 관련있는 종양 모형으로 이것을 설치할 수 있었습니다. 우리는 CCl4 및 MTD2 간세포로 처리된 마우스가 HCC 관련 항원, AFP 및 GPC336을발현하는 종양을 개발했다는 것을 보여주었다. 병리학은 우리의 뮤린 모형에 있는 병변이 인간 HCC에 거시적으로 그리고 병리학적으로 둘 다 유사하다는 것을 결정했습니다. 이 신뢰할 수 있는 모형 및 개발된 공구를 활용하여, 우리는 HCC 발달의 기계장치 및 임상으로 유효한 처리의 기계장치에 통찰력을 포함하여 이 복잡한 인간적인 질병을 공부할 수 있습니다.
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Disclosures
선언할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH / NCI R01 CA16435-01A1 (K. F. 스타벨리 - 오 캐롤, PI) 및 NIH / NCI R01CA208396 (마크 케스터, 광푸 리, 케빈 F. 스타벨리 - 오 캐롤)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | VETEQUIP | IMPAC6 | anesthesia machine for surgery |
| Butterfly needle | BD | 8122963 | Needle used for liver perfusion |
| C57BL/6 mice | Jackson Lab | 000664 | mice used in prototol |
| Carprofen | CRESCENT CHEMICAL | 20402 | carprofen for pain release |
| Cell Strainer | CORNING | REF 431751 | Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | centrifuge for cell isolation |
| Clips | Teleflex Medical | REF 523700 | Titanium Clips for spleen |
| Microscope | Zeiss | Primovert | microscope for cell observation |
| Mtd2 mice | N/A | Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab | |
| Needle | BD | REF 305109 | BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm) |
| Suture | ETHICON | J303H | coated VICRYL suture |
| SV40 T Ag antibody | Abcam | ab16879 | anti-SV40 T-antigen antibody for IHC |
| Syringe | BD | REF 309626 | 1 mL TB syringe for cell injection |
| Trypan blue | SIGMA | T 8154 | Trypan blue solution for cell viability test |
| Wound clips | Reflex | reflex9, Part. No. 201-1000 | stainless steel wound clips for wound close |
References
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- Petrick, J., Kelly, S., Altekruse, S., McGlynn, K., Rosenberg, P. Future of Hepatocellular Carcinoma Incidence in the United States Forecast Through 2030. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. 34, 1787-1794 (2016).
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