Summary
Burada, hepatosellüler kanserin (HCC) tipik bağışıklık özelliklerini özetlemek için karaciğer kanserinin klinik olarak ilgili bir murine modelinin gelişimini açıklıyoruz.
Abstract
Hepatosellüler kanserin (HCC) tipik bağışıklık özelliklerini ele alan klinik olarak alakalı bir hayvan modelinin olmaması, altta yatan mekanizmaların açıklanmasını ve yenilikçi immünterapötik stratejilerin geliştirilmesini önemli ölçüde engellemiştir. İnsan HCC'yi recapite eden ideal bir hayvan modeli geliştirmek için, immün omübusta erkek C57BL/6J fareler önce karaciğer fibrozisini tetiklemek için karbon tetraklorür (CCl4)enjeksiyonu alır, sonra genç erkekten histolojik olarak normal onkojenik hepatosit alırlar SV40 T antijeni (TAg)-transgenik fareler (MTD2) intra-dalak (ISPL) aşısı ile. Ergenlik te alıcı erkek farelerde üretilen Androjen karaciğere özgü bir organizatörün kontrolü altında TAg ifadesini başlatır. Sonuç olarak, transfer hepatositler kanser hücresi haline gelir ve karaciğer fibrozis / siroz ayarında tümör kitleleri oluşturur. Bu yeni model karaciğer fibrozis / siroz bağlamında insan HCC inisiyasyon ve ilerleme taklit ve bağışıklık disfonksiyonu da dahil olmak üzere insan HCC en tipik özelliklerini yansıtır.
Introduction
Hepatosellüler kanser (HCC) Amerika Birleşik Devletleri'nde kanser in en hızlı artan türüdür (ABD)1,2,3. Her yıl, yaklaşık 850.000 yeni olgu teşhis edilir4,5 ve 700,000 hasta bu ölümcül hastalıktan ölür6,7,8,9,10 , kansere bağlı ölüm dünya çapında ikinci en yüksek nedeni yapma. HCC'nin yönetimi cerrahi rezeksiyon, transplantasyon, ablasyon, kemoembolizasyon veya sorafenib11gibi sistemik tedavileri içerir. Cerrahi rezeksiyon veya transplantasyon ile erken tanı ve tedavi en yüksek genel sağkalım avantajına sahiptir4. Ne yazık ki, hastaların çoğunluğu daha sonraki bir aşamada mevcut ve ablasyon, kemoembolizasyon veya sorafenib12ile yönetim gerektirir. Sorafenib, bir reseptör tirozin kinaz inhibitörü (RTKI), Gıda ve İlaç İdaresi tarafından 2008 yılında rezeke edilemeyen HCC tedavisinde mevcut tek sistemik ilaç tedavisi olarak onaylanmıştır. İlaç sadece genel sağkalım mütevazı bir artış sağlar rağmen, 7.9 için 10.7 ay13,HCC yönetmek için kullanılabilir yeni bir tedavi stratejisi sağladı.
Kurulan kanserleri ortadan kaldırmak için bağışıklık sistemini manipüle kanser araştırma hızla büyüyen bir alandır14. Bağışıklık kontrol noktası çalışmaları kanser tedavisinde önemli ölçüde ileri immünterapötik ilaç gelişimi var15,16. FDA sitotoksik T-lenfosit antijen4 (CTLA-4), programlanmış hücre ölüm proteini 1 (PD-1) ve melanom tedavisi için ligand PD-L1 karşı antikorların (Abs) kullanımını onayladı, akciğer kanseri, baş ve boyun kanseri, ve mesane kanseri17, 18.000 , 19.09.20 , 20. Gelişmiş HCC tedavisi için PD-1, PD-L1 veya CTLA-4 karşı bir veya birden fazla antikor kullanılarak monoterapi veya kombinasyon tedavisi klinik çalışmalar devam etmektedir21,22,23, ve bazı denemeler olumlu sonuçlar göstermiştir. 2017 yılında FDA, sorafenib direnci olan HCC hastalarını tedavi etmek için anti-PD-1 antikor için hızlandırılmış onay verdi, ancak bu tedavinin genel yanıt oranı sadece %14,3'tür. Diğer stratejiler şu anda klinik uygulamaya çevrilmemiştir24,25. Bağışıklık kontrol noktası tedavisi geliştirmek için tümör kaynaklı derin bağışıklık toleransı üstesinden26; immün kontrol noktası tedavisinin etkinliğini tahmin etmek; bağışıklık la ilgili advers olayları önlemek; yönetim rotasını, dozajı ve sıklığını optimize etmek; vetedavilerinetkili kombinasyonları bulma 27,28,29 tüm son derece zorlu görevleri kalır.
Şu anda fare modellerinde HCC indüklemek için kullanılan çeşitli geleneksel yaklaşımlar vardır ve araştırmacının özel araştırma soru30bağlı olarak kullanılmaktadır. Kimyasal olarak indüklenen HCC fare modelleri ve genotoksik bileşikler yaralanmaya bağlı maligniteyi taklit eder. HCC hücre hatlarının ektopik veya ortotopik implantasyonu ile ksenogreft modelleri ilaç taraması için uygundur. Genetiği değiştirilmiş fareler bir dizi HCC patofizyolojisi araştırmak için yapılmıştır. Viral genleri, onkogenleri ve/veya büyüme faktörlerini ifade eden transgenik fareler hepatokarsinogenezde yer alan yolların belirlenmesine olanak sağlar. Doğal sınırlamalar nedeniyle, bu modeller insan HCC görülen tipik bağışıklık özellikleri recapitulate yok, hangi önemli ölçüde altta yatan mekanizmaların açıklanması ve yenilikçi immünoterapötik stratejilerin geliştirilmesi engelvardır14 ,15. Yakın zamanda klinik olarak uygun bir murine modeli oluşturduk. Bu yeni model sadece insan HCC inisiyasyon ve ilerleme taklit değil, aynı zamanda bağışıklık disfonksiyonu da dahil olmak üzere insan hastalığının en tipik özelliklerini yansıtır. Biyolojik ve immünolojik özelliklerini karakterize ettik. Bu yeni model yararlanarak, biz HCC31,32,33,34,35,36 , tedavi etmek için çeşitli immünoterapötik stratejiler araştırdık 37- Bu benzersiz platform bize tümör kaynaklı immünotolerans mekanizmaları çalışma ve nihai klinik çeviri doğru HCC için kanıt-of-kavram tedavi stratejileri geliştirmek için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Hayvan konuları da dahil olmak üzere tüm prosedür Missouri Üniversitesi'nde IACUC tarafından onaylanmıştır. Tüm fareler "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu"nda belirtilen kriterlere göre insancıl bakım almıştır. Hücre izolasyonu ve aşılama için aşağıdaki prosedür bir başlık içinde yapılmalıdır. Tüm sanatçılar fare ve doku kullanımı için standart kişisel koruyucu ekipman giymelidir.
1. Karbon Tetraklorür IP Enjeksiyonu ile Karaciğer Fibrozis ve Siroz İndüksiyonu (CCl4)
NOT: Bkz. Şekil 1. (CCl4 son derece tehlikeli reaktif, dikkatle ve kimyasal dirençli eldiven giyen ile ele alınmalıdır)
- Altı ila sekiz haftalık erkek C57BL/6J fareler edinin (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Bir santrifüj tüpünde mısır yağı % 10 CCl4 (v /v) çözeltisi hazırlayın. Enjekte edilecek fare sayısına göre toplam hacmi belirleyin (bkz. adım 1.6).
- Enjeksiyon için bir fare seçmek için uygun fare işleme tekniğini kullanın.
- Fareyi dorsal (karın) tarafı yukarı ile elle dizginle.
- % 70 alkol ile ovma tarafından farenin karın duvarında enjeksiyon sitesi temizleyin.
- Erkek C57BL/6J farelere 25-gauge tek kullanımlık iğne kullanarak intraperitoneal (IP) enjeksiyonu ile %10 CCl4 çözeltisi enjekte edin.
- İğnenin karın duvarından (yaklaşık 4-5 mm) yavel tarafı yukarı ve 15-20 derecede hafifçe açılı olarak nüfuz ettiğinden emin olun.
- Toplam dört hafta boyunca haftada iki kez fare enjekte edin-her fareye toplam sekiz enjeksiyon yapılacaktır.
NOT: Son enjeksiyondan iki hafta sonra, tedavi edilen fareler MTD2 farelerinden onkojenik hepatositlerin ISPL aşısı için hazırdır.
2. Line MTD2 farelerinden Etiket-transgenik Hepatositlerin İzine
NOT: Çözüm tarifleri için Tablo 1'e bakınız.
| Ca veya Mg olmadan 10x Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (Ca veya Mg olmadan EBSS) | 4 g KCl 68 g NaCl 1.4 g NaH2PO4· H2O 10 g dekstroz 1 litreye su ekleyin, pH'ı 4,32'ye Filtreden geçme |
| Çözüm 1 | Ca veya Mg olmadan 20 mL 10x EBSS 44 g NaHCO3 1.33 mL 1.5M Hepes 10 mL 10 mL EGTA 200 mL'ye su ekleyin |
| Çözüm 2 | 100 mL 10x EBSS 2.2 g NaHCO3 6,67 mL 1,5 M Hepes 1 litreye su ekleyin |
| %0.75 kollajenaz çözeltisi | 15 mg kollajenaz tip 1 20 mL çözelti 2 |
| Komple Orta | 2 RPMI 50 mL FBS 5 mL 100x Penisilin-Streptomisin |
Tablo 1: Çözüm tarifleri.
- Onkojenik hepatosit kaynağı olarak hizmet vermek için MTD2 fare38 hattını edinin.
- % 2.5 isofluran kullanarak 5 haftalık MTD2 fareler anestezik.
NOT: Uygun anestezi, parmak sıkıştırma yöntemi ile kontrol edilecektir. Kısacası, iki parmak kullanarak, fare ayak / ayak iyi bir sıkmak vermek. Eğer geri çekilme reaksiyonu yoksa, hayvan ameliyata başlayacak kadar derin emilir. - Yeterince sakinleştirildiğinde, fareleri bir supine pozisyona yerleştirin ve karın yüzeyinin yeterli pozlamasını sağlamak için ekstremiteleri bantla düzeltin.
- Linea alba uzunluğu boyunca karaciğer yeterli bir pozlama sağlamak için yeterince büyük makas kullanarak bir orta hat laparotomi kesi gerçekleştirin.
- Karaciğer ve portal triad daha iyi maruz kalmak için sola bağırsak yerinden.
- Inferior vena kava (IVC) ortaya çıkarmak için karaciğer üzerinde diseksiyon.
- Bir arter kelepçesi kullanarak karaciğer üzerinde IVC ligate.
- Karaciğerinferior sınıra dönen, portal ven IV erişim elde etmek için bir kelebek iğnesi (malzemelere bakın) kullanın. Kateteri elle düzeltin.
- Fare karaciğerini 8,9 mL/dk'da 15 mL çözelti 1, 15 mL %0,75 kollajenaz çözeltisi 2 ve 15 mL çözelti 2 ile kateter üzerinden bir enjeksiyon şırıngası ile aşılayın.
- 10-15 mL PBS ile 50 mL konik tüp içinde MTD2 farelerden tümör kütlesini keserek ve alarak perfüzyonlu karaciğeri hasat edin.
- PBS'yi çıkarın ve PBS ile ek bir süre yıkayın; bu adımda santrifüj etmeyin.
- Makas kullanarak küçük parçalar halinde karaciğer kesin ve sonra kalan kan kaldırmak için PBS 2x ile tekrar yıkayın.
- Konik tüpe 5 mL tam RPMI ortamı ekleyin ve karaciğeri makasla küçük parçalara sürekli olarak kıyıntın (<3 mm)-doku 5 mL'lik bir pipetten sorunsuz bir şekilde geçmelidir.
- Son 30 mL hacmine komple RPMI ekleyin ve 5 mL'lik pipet kullanarak karaciğeri askıya alın.
- Karışık çözeltiyi 70 m'lik süzgeçle 50 mL konik bir tüpe süzün.
- Süzgeci tam RPMI ile birkaç kez yıkayın ve ek RPMI ortamı ekleyerek son hacmi 50 mL'ye ayarlayın.
- Süspansiyonu santrifüj ile hızlı bir şekilde maksimum 500 rpm'ye çevirin; hız 50 x ghızlandıktan sonra santrifüj durdurulmalıdır.
- 20 mL PBS'de süpernatantve askıda peletleri decant.
- Trypan mavisi dışlama ve hemositometre kullanarak hücreleri sayın, ardındanaşağıdaki hücre aşısı için hücre konsantrasyonu 2,5 x 10 6/mL olarak ayarlayın.
NOT: Tümör dokusunun 5 gram beklenen verimi 80 milyon hepatosit ve canlılık >%95'tir.
3. MTD2 farelerinden hepatositlerin ISPL enjeksiyonu ile yabani tip C57BL/6J farelerin karaciğerine aşılanma
- Aseptik teknik tüm prosedürlerde kullanılmalıdır
- % 2.5 isofluran eile CCl4tedavi erkek C57BL/6J fareler anestezi, fareler kurumasını gözleri önlemek için göz yağlanması ile tedavi edilmelidir.
- Enjeksiyon için 200 μL hepatosit içeren şırıngalar hazırlayın.
- Yeterince sakinleştirildiğinde, fareleri sol tarafı yukarı doğru konumlandırın.
- Farelerin sol kanadının tamamını tıraş edin, sonra bölgeyi temizleyin, %70 alkol ve betadin arasında üç kez dönüşümlü olarak.
- Cerrahi kesiden önce 5 mg/kg karprofen subkutan uygulayın.
- Omurga kasının hemen altından başlayarak dorsal aşırı dan13 kaburga paralel sol kanadında 1 cm kesi olun.
- Dalağını tanımlayın, sonra künt uçlu forceps kullanarak dışa doğru dışlayın.
- Dalağını orta boy iki titanyum klipsle kes. Dalak arter ve damar arasında her iki klips yerleştirin, aşıdan sonra daha sonra kesmek için klipsler arasında oda bırakın.
NOT: Amaç tohumlama riskini azaltmak için dalak alt kutup izole etmektir. - Hazırlanan hepatositlerin 200°L'sini (0,5 milyon) 27 G iğne kullanarak dalak alt direğine enjekte edin.
- Pedikülinferior dalı klip (inferior dalak kutup damarları) bir orta ölçekli klip ile.
- Başlangıçta yerleştirilen iki klips arasındaki dalağını kesin.
- Doğrudan tümör hücreleri ile enjekte edildi dalak inferior kutup çıkarın.
- İç kas tabakasını kapatmak için 3-0 poliglactin 910 kesmedikiş kullanın.
- Dış deri tabakasını kapatmak için sterilize edilmiş çelik yara klipsleri kullanın.
NOT: Çelik klipsler, hayvanların dikişleri çiğnemesini önlemek ve açık bir yara bırakmak için dikişlerin üzerine tercih edilir. - Dikiş ten sonra 5 mg/kg karprofen deri altı uygulayın.
- Tüm iyileşen hayvanları sıcaklık kontrollü bir ısıtma yastığına yerleştirin ve anesteziden tamamen iyileşene kadar yakından izleyin.
- Farelere ameliyattan sonra suya ücretsiz erişim hakkı verin. Ameliyat sırasında fare susuz kalırsa, deri altı sıvılar (<1 mL) uygulayın.
- Ameliyat sonrası 7-10 gün cilt kliplerini çıkarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TAg-transgenik farelerden izole edilen onkojenik hepatositler(Şekil 2)intra-dalak enjeksiyonu ile yabani tip farelerin karaciğerinde tohumlandılar (Şekil 3). Nakledilen hepatositler hepatik inflamasyon ve fibrozis ortamında tümöre özgü antijen SV40 TAg(Şekil 5)ile başarılı ve güvenilir bir şekilde büyümüş ortotopik HCC tümörleri(Şekil 4)(Şekil 1).
Şekil 1: HCC fare modeli hazırlamak için şematik. HCC yenilikçi bir murine modeli oluşturmak için deneysel tasarım. C57BL/6J fareler ilk karaciğer fibrozis indüklemek için dört hafta boyunca haftada iki kez CCl4 IP enjeksiyonu ile tedavi edilir. Son IP enjeksiyonunu takip eden iki hafta sonra, CCl4ile tedavi edilen fareler, ISPL aşısı yoluyla genç erkek MTD2 farelerinden izole edilen hepatositalırlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: MTD2 farehattından hepatositlerin izolasyonu ve saflaştırılması. (A) MTD2 farelerinden izole edilen hepatositler protokole göre hazırlanmış ve hücre izolasyonunun canlılığını ve saflığını saptamak için trypan mavisi ile boyanmıştır. Sol panel, hücre ekstraksiyonu sırasında izole edilen hepatositler (siyah ok) ve tümör emzme lenfositleri (kırmızı oklar) gösterir. Sağ panel, hepatositler (siyah ok) ve lenfositlere sızan tümör de dahil olmak üzere düşük hızlı santrifüjden sonra kalan hücre popülasyonunu gösterir. Büyütme = 10x amaç, ölçek çubuğu = 100 μm. (B) MTD2 farelerden izole edilen hepatositler, yabani tip C57BL/6J farelerin aşılanmasından önce trippan mavisi çözeltisi ile boyanır. Canlılık >%95 ise hücre izolasyonu başarılı olarak belirlenir. Ölü hücreler trypan mavisi (kırmızı oklar) ile boyanırken, canlı hücreler lekelenmez (siyah ok). Büyütme = 10x amaç, ölçek çubuğu = 100 μm. Sağdaki grafik, hepatositlerin %95'inin uygulanabilir olması ile hücre izolasyonunun sonuçlarını, istatistiksel verilerin mikroskop altında 5 farklı gözlenen alandan geldiğini; hata çubukları temsil +SD. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yabani tip C57BL/6J farelerin karaciğerine hepatositlerin intrasplenik aşılaması. Hepatositlerin ISPL aşısı için c57BL/6J farelerde HCC indüklemek için deneysel tasarım. (1) Dalak tanımlanır ve dışlanır. (2) Dalak iki orta boy titanyum klips ile kırpılır. (3) Hazırlanan hepatositler dalanın alt kutbuna enjekte edilir. (4) Pedikül inferior dalı (inferior dalak kutup damarları) bir orta boy klip ile kırpılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: MTD2-hepatositlerle aşılama sonrası C57BL/6J farelerde progresif tümör gelişimi. (A) Hepatosellüler karsinom (HCC) ortotopik tümör modeli protokole göre kurulmuştur. Anatomik görüntüler aşılamadan önce ve alt sıralı zaman kurslarında alınmıştır. (a) MTD2 hepatositleri ile aşılama dan önce sağlıklı karaciğer gösterir. (b) Fare karaciğeri 3 ay sonrası inoülasyon ile brüt tümör gelişimi kanıtıdır. (c) 3.5 ay artan tümör yükü ile aşılama sonra. (d) aşıdan 4,5 ay sonra. (e) karaciğer boyunca tümör kanıtı ile aşı dan sonra 6 ay. (B) Tümör nodülleri MTD2 hepatositleri ile aşılama sonrası belirtilen zaman noktalarında hasat edildi ve tartıldı. Hata çubukları temsil +SD. ***P < 0.001, istatistiksel analiz t-testleri ile yapıldı. (C) Yabani tip ve MTD2 aşılanmış karaciğer bölümlerinin temsili görüntüleri. Hematoksilin ve eozin (H&E) boyama psödogland oluşumunu (siyah oklar) betimleer. Nükleer kalabalık vardır ve tümör hücreleri yüksek çekirdek-sitoplazma oranları (büyütülmüş görüntü) ile eozinofilik vardır. Büyütme = 20x amaç, ölçek çubuğu = 50 μm. Sağ üstteki insets daha el ile yükseltilir. (D) Sirius kırmızı boyama anormal kollajen birikimini gösteren, karaciğer fibrozisi ile tutarlı. Büyütme: 40x amaç, ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Tümörde SV40 T antijen geninin spesifik tespiti. (A) Fareler de tümör dokusu ve ek doku örnekleri tümörlü farelerden toplanmıştır. Genomik DNA dokudan izole edildi ve hem SV40 T Ag hem de P53 (kontrol) konvansiyonel PCR için sentezlendi. Tümör dokusunda SV40 T antijen geni saptandı ancak farelerde normal doku da veya diğer dokularda mevcut değildir. (B) Tümör dokusu tümör taşıyan farelerden toplanmış ve anti-SV40 T antijen antikor ile boyanmıştır. Sol panel naif farelerden toplanan sağlıklı karaciğer dokusundan negatif bir kontroldür. Sağ panel, tümör taşıyan farelerden (kahverengi renk) toplanan tümör dokusunun önemli SV40 T antijen boyaması gösterir. Büyütme = 40x amaç, ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol ile, insan HCC inisiyasyon ve ilerlemesini taklit eden güvenilir ve tekrarlanabilir bir hcc murine modeli oluşturduk. Klinik olarak, birçok risk faktörü art arda karaciğer hasarı, karaciğer fibrozisi, siroz ve HCC son aşaması neden. Protokolümüzde, CCl4 IP enjeksiyonu ilk olarak yabani tip farelerde karaciğer fibrozisi üretmek için kullanılır, bu da sonraki onkojenik hepatositlerin karaciğer fibrozisi ortamında tümörleri oluşturmasına olanak sağlar. CCl4 tedavisinden iki hafta sonra hepatosit aşısı yapılan farelerde tümör oluşumunun en başarılı şekilde meydana geldiğini, diğer zaman noktalarında enjeksiyon alan farelere kıyasla. Buna ek olarak, karaciğer fibrozisi CCl4 enjeksiyonundan dört aya kadar saptanabilir bulundu. Bu yaklaşım, CCl4'emaruz kalmadan farelere göre HCC tümörleri geliştiren farelerin %90'ından fazlasının sonuçlanmaktadır. Modelimizde, mtd2 farehattından C57BL/6J farelere aktarılan hepatositler, tag'yi doku antijeni olarak ifade eden hepatosit olarak dahil oldukları karaciğere trafik verirler. Hepatositlerin MTD2'den izolasyonu bu protokol sırasında kritik bir adımdır. MTD2 fare karaciğerleri tamamen karaciğer içinde dolaşan kırmızı kan hücrelerini kaldırmak için çözelti 1 ve 2 ile iyice perfüzyon. Kollajenaz çözeltisi hepatosit serbest bırakmak için uygun karaciğer sindirim oluşturmak için belirtilen konsantrasyon ve hızda karaciğer perfüzyon için kullanılır. Kollajenaz düşük konsantrasyonlarda kullanımı sindirim için yetersiz, hepatosit kümeleri ile sonuçlanan. Buna karşılık, yüksek konsantrasyonlarda doku üzerinde çok sert, canlı hepatosit önemli bir azalma ile sonuçlanan. Ayrıca, protokolümüzde açıklandığı gibi kısa santrifüjün hepatositlerin saflığını artırmak için gerekli olduğunu da görüyoruz. Santrifüj için kullandığımız alt spin hepatositleri çökeltebilir ve bu iki hücre türünün yoğunluk farkı nedeniyle lökositleri süpernatantta bırakabilir.
Bir sonraki kritik adım yabani fareler içine hepatosit aşılama için rotadır. Pilot çalışmalarımızda hepatosit aşısı yapmanın çeşitli yollarını araştırdık. Karaciğerde başarılı ortotopik tümör büyümesi fare başına yarım milyon hücre dozda onkojenik hepatosit intrasplenik aşılama alan farelerde en iyi görülür, sıçanlar kuyruk ven ve intraperitoneal ile yönetilen hücreleri alan fareler ile karşılaştırıldığında çeşitli dozlarda enjeksiyon. Bu bulgular ortotopik HCC büyümesinin rota ve doza bağlı olduğunu düşündürmektedir. Malign dönüşüm yavaş yavaş gerçekleşir ve tüm karaciğer parankim yerine nakledilen hepatositlerin alt popülasyonu ile sınırlıdır. Devam eden hücre çoğalması, karaciğerde gelişen tümör nodülleri ile sonuçlanır.
HCC veya diğer kanserler ilerleme için bağışıklık sistemi kaçınmak gerekir; aslında, bağışıklık imha kaçınarak şimdi kanser bir özelliği olarak kabul edilir39. Ancak, tümöre özgü antijen eksikliği altta yatan mekanizmaları niçin aydınlatılabilmek için kritik bir engeldir. Modelimizde, TAg tümörlerde ifade edilir, diğer organlarda değil, tümöre özgü bir antijen olarak hareket eder. Ayrıca, TAg C57BL/6J farelerde CD8 T hücreleri tarafından tanınabilir çok sayıda iyi tanımlanmış epitopya vardır. TAg epitop-I ile ilgili olarak, bu epitop34için T hücre reseptörlerini transgenically ifade hattı 416 fareler oluşturduk. Tümör antijene özgü immün yanıtı incelemek için TAg'ı hedeflemek, tümör inisiyasyonu ve progresyonu sırasında tümör immün gözetimini araştırmamıza olanak sağlar, bu da DEN veya genetik manipülasyon tarafından indüklenen modeller kullanılarak mümkün değildir. Altta yatan mekanizmaların aydınlatılmasını, tümöre bağlı bağışıklık toleransına aracılık eden kritik hücreleri ve molekülleri belirlememizi sağlar. Bu temel faktörlerin hedeflanması, HCC'ye karşı yenilikçi immünoterapötik stratejiler geliştirmemizi önemli ölçüde ilerletebilir. Bu benzersiz HCC modeli ve yerleşik araçları kullanarak, tümör kaynaklı tolerans25,35 altında yatan mekanizmaları araştırdık ve çeşitli bağışıklık tabanlı antitümör immünoterapiler31,32 araştırdık , 36.000 , 37'ye kadar.
Özetle, HCC bizim kurulan murine modeli insan hastalığının bazı tipik özelliklerini yansıtır. Daha önce yayınlanan yazımızda, bunu insan HCC'nin tipik özelliklerine sahip klinik olarak uygun bir tümör modeli olarak tespit edebildik. Biz fareler CCl4 ve MTD2 hepatositile tedavi hcc ilişkili antijenler, AFP ve GPC336ifade tümörler geliştirdi gösterdi. Patoloji, mürin modelimizdeki lezyonların hem makroskopik hem de patolojik olarak insan HCC'sine benzediğini saptırdı. Bu güvenilir model ve gelişmiş araçlar yararlanarak, biz HCC geliştirme mekanizmaları ve klinik olarak mevcut tedavi içine anlayış da dahil olmak üzere bu karmaşık insan hastalığı inceleyebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Beyan ediletecek bir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O'Carroll, PI) ve NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu Li, Kevin F. Staveley-O'Carroll) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | VETEQUIP | IMPAC6 | anesthesia machine for surgery |
| Butterfly needle | BD | 8122963 | Needle used for liver perfusion |
| C57BL/6 mice | Jackson Lab | 000664 | mice used in prototol |
| Carprofen | CRESCENT CHEMICAL | 20402 | carprofen for pain release |
| Cell Strainer | CORNING | REF 431751 | Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | centrifuge for cell isolation |
| Clips | Teleflex Medical | REF 523700 | Titanium Clips for spleen |
| Microscope | Zeiss | Primovert | microscope for cell observation |
| Mtd2 mice | N/A | Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab | |
| Needle | BD | REF 305109 | BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm) |
| Suture | ETHICON | J303H | coated VICRYL suture |
| SV40 T Ag antibody | Abcam | ab16879 | anti-SV40 T-antigen antibody for IHC |
| Syringe | BD | REF 309626 | 1 mL TB syringe for cell injection |
| Trypan blue | SIGMA | T 8154 | Trypan blue solution for cell viability test |
| Wound clips | Reflex | reflex9, Part. No. 201-1000 | stainless steel wound clips for wound close |
References
- O'Connor, S., Ward, J. W. Hepatocellular carcinoma - United States. Morbidity and Mortality Weekly Report. 59, 517-520 (2010).
- Petrick, J., Kelly, S., Altekruse, S., McGlynn, K., Rosenberg, P. Future of Hepatocellular Carcinoma Incidence in the United States Forecast Through 2030. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. 34, 1787-1794 (2016).
- Greten, T., Lai, C., Li, G., Staveley-O'Carroll, K. Targeted and Immune-based Therapies for Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology. 156, 510-524 (2019).
- Llovet, J., Zucman-Rossi, J., Pikarsky, E., Sangro, B., Schwartz, M., Sherman, M., Gores, G.
- Ding, X., et al. Precision medicine for hepatocellular carcinoma: driver mutations and targeted therapy. Oncotarget. 8, 55715-55730 (2017).
- Colombo, M., Maisonneuve, P. Controlling liver cancer mortality on a global scale: still a long way to go. Journal of Hepatology. 67, 216-217 (2017).
- Llovet, J., Burroughs, A., Bruix, J.
- Parkin, D., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. International Journal of Cancer. 94, 153-156 (2001).
- Thomas, M., Zhu, A. Hepocellular carcinoma: the need for progress. Journal of Clinical Oncology. 23, 2892-2899 (2005).
- Llovet, J., Bruix, J. Molecular targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 48, 1312-1327 (2008).
- Bruix, J., Sherman, M. Management of hepatocellular carcinoma: an update. Hepatology. 53, 1020-1022 (2011).
- Pang, T., Lam, V.
- Llovet, J., et al. Design and endpoints of clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of the National Cancer Institution. 100, 698-711 (2008).
- Mueller, K. Cancer immunology and immunotherapy. Realizing the promise. Introduction. Science. 348, 54-55 (2015).
- Gajewski, T., Schreiber, H., Fu, Y. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14, 1014-1022 (2013).
- Ribas, A., Wolchok, J. Combining cancer immunotherapy and targeted therapy. Current Opinion in Immunology. 25, 291-296 (2013).
- Postow, M., Callahan, M., Wolchok, J. Immune checkpoint blockade in cancer therapy. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 33, 1974-1982 (2015).
- Gao, J., et al. VISTA is an inhibitory immune checkpoint that is increased in ipilimumab therapy in patients with prostate cancer. Nature Medicine. 23, 551-555 (2017).
- Hahn, A., Gill, D., Pal, S., Agarwal, N. The future of immune checkpoint cancer therapy after PD-1 and CTLA-4. Immunotherapy. 9, 681-692 (2017).
- Remon, J., Besse, B. Immune checkpoint inhibitors in first-line therapy of advanced non-small cell lung cancer. Current Opinion in Oncology. 29, 97-104 (2017).
- Kudo, M. Immune checkpoint blockade in hepatocellular carcinoma: 2017 update. Liver Cancer. 6, 1-12 (2017).
- Kudo, M. Immune checkpoint inhibition in hepatocellular carcinoma: Basics and ongoing clinical trials. Oncology. 92, 50-62 (2017).
- Breous, E., Thimme, R. Potential of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 54, 830-834 (2011).
- Sprinzl, M., Galle, P. Facing the dawn of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 59, 9-10 (2013).
- Liu, D., Staveley-O'Carroll, K., Li, G. Immune-based therapy clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of Clinical Cell Immunology. 6, 376 (2015).
- Greten, T., Wang, X., Korangy, F. Current concepts of immune based treatments for patients with HCC: from basic science to novel treatment approaches. Gut. 64, 842-848 (2015).
- Koster, B., de Gruijl, T., van den Eertwegh, A. Recent developments and future challenges in immune checkpoint inhibitory cancer treatment. Current Opinion in Oncology. 27, 482-488 (2015).
- Johnson, D., Sullivan, R., Menzies, A. Immune checkpoint inhibitors in challenging populations. Cancer. 123, 1904-1911 (2017).
- Li, H., et al. Programmed cell death-1 (PD-1) checkpoint blockade in combination with an mTOR inhibitor restrains hepatocellular carcinoma growth induced by hepatoma cell-intrinsic PD-1. Hepatology. 66, 1920-1933 (2017).
- Heindryckx, F., Colle, I., van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
- Qi, X., et al. Development of inCVAX, in situ cancer vaccine, and its immune response in mice with hepatocellular cancer. Journal of Clinical and Cellular Immunology. 7, 438 (2016).
- Qi, X., et al. Development of a radiofrequency ablation platform in a clinically relevant murine model of hepatocellular cancer. Cancer Biology and Therapy. 16, 1812-1819 (2015).
- Liu, D., et al. Sunitinib represses regulatory T cells to overcome immunotolerance in a murine model of hepatocellular cancer. Oncoimmunology. 7, 1372079 (2017).
- Staveley-O'Carroll, K., et al. In vivo ligation of CD40 enhances priming against the endogenous tumor antigen and promotes CD8+ T cell effector function in SV40 T antigen transgenic mice. Journal of Immunology. 171, 697-707 (2003).
- Avella, D., et al. Regression of established hepatocellular carcinoma is induced by chemoimmunotherapy in an orthotopic murine model. Hepatology. 55, 141-152 (2012).
- Li, G., et al. Successful chemoimmunotherapy against hepatocellular cancer in a novel murine model. Journal of Hepatology. 66, 75-85 (2017).
- Li, G., et al. Nanoliposome C6-ceramide increases the anti-tumor immune response and slows growth of liver tumors in ice. Gastroenterology. 154, 1024-1036 (2018).
- Held, W., et al. T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene. EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).
- Hanahan, D., Weinber, R.
