Lipidomics en Transcriptomics bij neurologische aandoeningen
Summary
Dit artikel presenteert een modulair protocol voor weefsellipideomica en transcriptomica, en plasmalipideomica in neurologische ziektemuismodellen gericht op lipiden die ten grondslag liggen aan ontsteking en neuronale activiteit, membraanlipiden, stroomafwaartse boodschappers en mRNA-coderende enzymen / receptoren die ten grondslag liggen aan de lipidefunctie. Bemonsterings-, monsterverwerkings-, extractie- en kwantificeringsprocedures worden beschreven.
Abstract
Lipiden dienen als de primaire interface voor hersenbeledigingen of stimuli die bevorderlijk zijn voor neurologische ziekten en zijn een reservoir voor de synthese van lipiden met verschillende signalerings- of ligandfuncties die het begin en de progressie van ziekten kunnen onderstrepen. Lipiden veranderen vaak op presymptomatisch niveau en zijn een opkomende bron van medicijndoelen en biomarkers. Veel neurologische ziekten vertonen neuro-inflammatie, neurodegeneratie en neuronale prikkelbaarheid als gemeenschappelijke kenmerken, gedeeltelijk gemoduleerd door specifieke lipide signaleringssystemen. De onderlinge afhankelijkheid en onderlinge samenhang van de synthese van verschillende lipiden leidt tot een multilipiden-, multi-enzym- en multireceptoranalyse om de overeenkomsten en specificiteiten van neurologische contexten af te leiden en de ontrafeling van mechanistische aspecten van het begin en de progressie van de ziekte te versnellen. Het toeschrijven van lipiderollen aan verschillende hersengebieden bevordert de bepaling van lipide moleculair fenotype en morfologie geassocieerd met een neurologische ziekte.
Hier wordt een modulair protocol gepresenteerd dat geschikt is voor de analyse van membraanlipiden en downstream lipidesignalen, samen met mRNA van enzymen en mediatoren die ten grondslag liggen aan hun functionaliteit, geëxtraheerd uit discrete hersengebieden die relevant zijn voor een bepaalde neurologische ziekte en / of aandoening. Om nauwkeurige vergelijkende lipidomische profilering te garanderen, werden de workflows en operationele criteria geoptimaliseerd en gestandaardiseerd voor: i) hersenbemonstering en dissectie van interessante regio’s, ii) co-extractie van meerdere lipidesignalen en membraanlipiden, iii) dubbele lipide / mRNA-extractie, iv) kwantificering door vloeistofchromatografie multiple reaction monitoring (LC / MRM), en v) standaard mRNA-profilering. Deze workflow is vatbaar voor de lage weefselhoeveelheden die worden verkregen door bemonstering van de functioneel discrete hersensubregio’s (d.w.z. door brain punching), waardoor bias in multimoleculaire analyse als gevolg van weefselheterogeniteit en / of dierlijke variabiliteit wordt voorkomen. Om perifere gevolgen van neurologische ziekten te onthullen en translationele moleculaire uitlezingen van neurologische ziektetoestanden vast te stellen, worden perifere orgaanbemonstering, verwerking en hun daaropvolgende lipidomische analyse, evenals plasmalipideomica, ook nagestreefd en beschreven. Het protocol wordt gedemonstreerd op een acuut epilepsiemuismodel.
Introduction
Recente ontwikkelingen in de functie van lipiden en hun rol in het begin en de progressie van neurologische ziekten openen nieuwe onderzoeks- en ontwikkelingslocaties van nieuwe therapeutische doelen en opheldering van het ziektemechanisme1. Gedocumenteerde verschillen in lipidesamenstelling in verschillende hersengebieden, benadrukt door moderne moleculaire beeldvormingstechnieken zoals massaspectrometrie beeldvorming en geavanceerde massaspectrometrieprofilering, verschuift het paradigma van lipidenonderzoek van hele hersenen naar functioneel verschillende en discrete hersengebieden. Het feit dat de lipidesamenstelling varieert in verschillende hersengebieden leidt tot nieuwe conceptualisering van zowel membraanlipidegevoeligheid als stroomafwaartse lipidesignalering als reactie op een hersenbelediging of stimuli in de functioneel verschillende hersengebieden. Daarom vereisen lipideprotocollen nieuwe ontwikkelingen om de uitdaging van lage weefselhoeveelheden aan te pakken voor detectie en kwantificering met een hogere ruimtelijke resolutie, en tegelijkertijd analyse van meerdere lipidecomponenten van celmembranen en signaalroutes. Ook de bepaling van enzymen, lipideliganden en receptoren die betrokken zijn bij de regulatie van hun niveaus en functie is van het grootste belang om de signaalroutes die bij een neurologische ziekte worden beïnvloed, op te helderen en nieuwe mechanistische onderzoeken in een pathofysiologische context te begeleiden.
Naast de verhoogde ruimtelijke resolutie van de hersenen, zijn er twee grote problemen die de ontwikkeling van nieuwe neurolipidomische benaderingen uitdagen. Ten eerste zijn de lipide-signaleringsmoleculen meestal van zeer lage abundantie in vergelijking met membraanvormende lipiden. Ten tweede vertoont het lipidoom een hoge structurele heterogeniteit, moeilijk te ontleden met behulp van een enkele analytische benadering. Daarom zijn extractie- en analysemethoden afgestemd op verschillende lipidecategorieën en worden ze vaak uitgevoerd in verschillende weefselmonsters2. Shotgun lipidomische methoden3 zijn uitstekende hulpmiddelen om snel een breed profiel van membraanlipiden te onthullen, terwijl verhoogde gevoeligheid en selectiviteit die worden geboden door de gerichte ontdekking en kwantificering massaspectrometrische methoden worden benut voor onderzoek van laag overvloedige signaallipiden, waaronder: i) inflammatoire lipiden en ii) lipiden die betrokken zijn bij de modulatie van neuronale activiteit, zoals endocannabinoïden (eCB’s), aminozuurgerelateerde lipiden, enz.4,5. Om lipideveranderingen op zowel het celmembraan als het signaleringsniveau te omvatten die optreden in hersengebieden van neurologische ziektemodellen, worden de lipide-extractie en -analyse meestal uitgevoerd in verschillende weefselmonsters, verkregen uit verschillende dierlijke batches of uit verschillende hemisferen, of door een groter weefselgebied in meerdere stukken te ontleden. Wanneer mRNA-niveaus van enzymreceptoren ook van belang zijn, vereist hun onderzoek meestal de verkrijging van een afzonderlijk weefselmonster. Het onderzoek van membraanlipiden, endogene cannabinoïden en mRNA zou bijvoorbeeld drie verschillende weefselmonsters vereisen (bijvoorbeeld twee monsters voor de twee lipide-extractiemethoden – membraanlipiden en signaleringslipiden – en daaropvolgende twee lipidenanalysemethoden – en één monster voor mRNA-analyse). Onderzoek naar inflammatoire lipiden en endogene cannabinoïden vereist respectievelijk twee verschillende weefselmonsters, extractiemethoden en analysemethoden. Een ander voorbeeld is het onderzoek van mRNA en van elke lipidecategorie in een hersenpunch- of lasermicrodissectiemonster, waardoor twee verschillende dieren twee monsters per hersengebied (sub)regio moeten verkrijgen. Een aanzienlijke mate van variabiliteit en/of slechte reproduceerbaarheid van de resultaten komt in dergelijke gevallen vaak voor, als gevolg van biologische variabiliteit en/of weefselheterogeniteit. Geleid door deze praktische beperkingen van multimoleculaire analyse, die met name optreden bij hoge ruimtelijke resolutie in de hersenen, werd een driemodule neurolipidomicsprotocol ontworpen dat omvat: 1) co-extractie en co-analyse door LC / MRM van inflammatoire lipiden (bijv. Eicosanoïden (eiCs)) en lipiden die betrokken zijn bij modulatie van neuronale activiteit, zoals eCB’s2; 2) co-extractie van fosfolipiden (PR’s) en eCB’s met daaropvolgende multiscan LC/MRM en precursor/neutrale verliesscananalyse2; en 3) dubbele extractie van membraan (fosfo)lipiden en eCB’s, evenals mRNA, met daaropvolgende LC/MRM en qPCR of RNA sequencing analyse6. Afhankelijk van de biologische vraag die moet worden behandeld bij een neurologische ziekte en het hersengebied van belang, kan een combinatie van het eerste en het tweede protocol, of het eerste en het derde protocol, worden toegepast op hetzelfde weefselmonster voor weefsels met een gewicht van ongeveer 4 mg. Het eerste en derde protocol kunnen onafhankelijk worden toegepast voor weefsels rond 2 mg. Het tweede protocol kan worden toegepast voor weefsels met een gewicht van slechts 0,5 mg. Ongeacht de geselecteerde neurolipidomische protocolmodule zijn de weefselbemonstering en pre-analytische verwerking, de hersenisolatie en regiodissectie, evenals de procedure voor het opofferen van het diermodel gestandaardiseerd en identiek voor alle drie de modules van het protocol. In ons onderzoek naar neurologische aandoeningen worden perifere organen die relevant zijn voor de pathologische gevolgen van de ziekte altijd ook verzameld en geanalyseerd met behulp van deze modulaire protocollen. Bovendien wordt bloed regelmatig bemonsterd voor plasmalipideomica om te dienen als een uitleesinstrument van neurologische ziekten met het oog op prospectieve translationele toepassingen. Het hier gepresenteerde modulaire lipidomics-protocol is zeer veelzijdig: schaalbaar naar grotere weefselhoeveelheden en gemakkelijk toepasbaar voor vrijwel elk weefseltype en elke ziekte. Voor de toepassing van het modulaire protocol (Figuur 1) bij neurologische ziekten is elk gestandaardiseerd knaagdiermodel van het begin en de progressie van neurologische aandoeningen, zoals traumatisch hersenletsel, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer of epilepsie vatbaar.
Deze protocollen zijn uitgebreid toegepast om veranderingen in het weefsellipideoom en /of transcriptoom in de acute fase van epilepsie te bestuderen in het door kaïnzuur (KA) geïnduceerde muismodel van epilepsie2,7, een model dat veel wordt gebruikt in preklinische studies vanwege de gelijkenis met humane temporale kwab epilepsie (TLE)8,9,10,11. Met behulp van deze protocollen werd het therapeutisch potentieel van geneesmiddelen zoals Palmitoylethanolamide (PEA)12,13 beoordeeld in hetzelfde muismodel van epilepsie. De studie identificeerde lipide- en mRNA-veranderingen bij hoge en lage ruimtelijke resolutie in de hersenen en periferie, op het tijdstip van maximale acute aanvalsintensiteiten (bij 60 min posteizure inductie), en bij subchronische en acute behandeling met PEA op vier verschillende tijdstippen (20, 60, 120 en 180 min) na KA-aanvalsinductie, een tijdvenster dat de acute fase van epilepsie bestrijkt. Plasma, hersenen en perifere organen van onbehandelde KA-geïnjecteerde muizen, acute en subchronisch PEA-behandelde muizen, evenals voertuig- en PEA-voertuigcontrolemuizen, werden verzameld op elk tijdstip12,13 en onderzocht met deze moleculaire analyse. De moleculaire gegevens werden gecorreleerd met gedragsfenotypen verkregen door het scoren van aanvallen, evenals met immunohistochemische afgeleide gegevens over neurodegeneratieve processen, om de progressie van de acute epilepsiefase en het potentieel van PEA om het te verlichten te ontrafelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De neurolipidomische en transcriptomische methodologie die hier wordt beschreven, is een levensvatbaar middel om elke ziekte of gezonde ontwikkeling bij hoge en lage ruimtelijke resolutie in de hersenen en perifere organen te onderzoeken. Vanwege de geoptimaliseerde plasmabemonsterings- en behandelingsprocedures kan plasmalipomische analyse ook worden uitgevoerd van dezelfde dieren die zijn opgeofferd voor weefsellipomica en transcriptomica, waardoor de betrouwbaarheid van moleculaire correlaten van weefselbloed en de on…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We dragen dit artikel op aan Dr. Ermelinda Lomazzo. Tijdens de voltooiing van dit manuscript overleed Dr. Ermelinda Lomazzo. Ze is de belichaming van passie voor wetenschap en onbaatzuchtige betrokkenheid bij teamwerk om een zinvol onderzoeksdoel te vervullen. Ze heeft er altijd van gedroomd om een zinvolle bijdrage te leveren aan het grotere welzijn van de mens. Haar goedhartige aard werd nooit aangetast door de inspannende wegen van wetenschap en leven. Ze zal van onschatbare waarde blijven, en voor altijd, in onze harten.
Julia M. Post werd gefinancierd door focusprogramma voor translationele neurowetenschappen (FTN) aan het Universitair Medisch Centrum van de Johannes Gutenberg Universiteit Mainz en wordt momenteel gefinancierd door het SPP-2225 EXIT-project aan LB. Raissa Lerner werd gedeeltelijk gefinancierd door DZHK-project 81X2600250 naar LB en Lipidomics Core Facility. Gedeeltelijke financiering voor deze studies werd verstrekt door de Lipidomics Core Facility, Institute of Physiological Chemistry en Intramurale fondsen (aan LB) van het Universitair Medisch Centrum van de Johannes Gutenberg Universiteit Mainz.
Materials
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
| ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
| Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
| Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
| Bino | Zeiss | Microscopy | |
| cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
| Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
| CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
| EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
| Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
| Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
| Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
| Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
| Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
| Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
| LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
| Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
| Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
| Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| Motic Camara | Motic | Microscopy | |
| MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
| MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
| PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
| PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
| PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
| PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
| Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
| Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
| Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
| Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
| PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
| Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
| Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
| Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
| Rneasy Mini Kit – RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
| Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
| Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
| SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
| SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
| Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
| Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
| T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
| Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
| Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
| Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |
References
- Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
- Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).
- Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
- Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).
- Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).
- Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).
- Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).
- Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).
- Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J. Microglia-Neuron Communication in Epilepsy. Glia. 65 (1), 5-18 (2017).
- Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079 (2011).
- Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. Role of α-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice. Peptides. 44, 158-162 (2013).
- Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice. Frontiers in Neuroscience. 13, 527 (2019).
- Post, J. M., et al. Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).
- Schauwecker, P. E., Steward, O. Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).
- Monory, K., et al. The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus. Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).
- Konsman, J. P. The mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).
- Spijker, S., Li, K. W. Dissection of Rondent Brain Regions. Neuroproteomics. 57, 13-27 (2011).
- Gross, R. W. The evolution of lipidomics through space and time. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Abbott, S. K., et al. An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids. Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).
- Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).
