Lipidomique et transcriptomique dans les maladies neurologiques
Summary
Cet article présente un protocole modulaire pour la lipidomique tissulaire et la transcriptomique, et la lipidomique plasmatique dans des modèles murins de maladies neurologiques ciblant les lipides sous-jacents à l’inflammation et à l’activité neuronale, les lipides membranaires, les messagers en aval et les enzymes/récepteurs codant pour l’ARNm sous-jacents à la fonction lipidique. Les procédures d’échantillonnage, de traitement des échantillons, d’extraction et de quantification sont décrites.
Abstract
Les lipides servent d’interface principale aux insultes cérébrales ou aux stimuli propices aux maladies neurologiques et sont un réservoir pour la synthèse des lipides avec diverses fonctions de signalisation ou de ligand qui peuvent souligner l’apparition et la progression des maladies. Changeant souvent au niveau présymptomatique, les lipides sont une source émergente de cibles médicamenteuses et de biomarqueurs. De nombreuses maladies neurologiques présentent la neuroinflammation, la neurodégénérescence et l’excitabilité neuronale comme caractéristiques communes, partiellement modulées par des systèmes de signalisation lipidique spécifiques. L’interdépendance et l’interrelation de la synthèse de divers lipides incitent à une analyse multilipide, multienzymatique et multiréceptrice afin d’en déduire les points communs et les spécificités des contextes neurologiques et d’accélérer le démêlage des aspects mécanistes de l’apparition et de la progression de la maladie. L’attribution de rôles lipidiques à des régions cérébrales distinctes fait progresser la détermination du phénotype moléculaire lipidique et de la morphologie associée à une maladie neurologique.
Présenté ici est un protocole modulaire adapté à l’analyse des lipides membranaires et des signaux lipidiques en aval ainsi que de l’ARNm des enzymes et des médiateurs sous-jacents à leur fonctionnalité, extraits de régions cérébrales discrètes pertinentes pour une maladie et/ou une affection neurologique particulière. Pour assurer un profilage lipidomique comparatif précis, les flux de travail et les critères d’exploitation ont été optimisés et normalisés pour : i) l’échantillonnage cérébral et la dissection des régions d’intérêt, ii) la co-extraction de multiples signaux lipidiques et lipides membranaires, iii) l’extraction double lipide/ARNm, iv) la quantification par chromatographie liquide par surveillance des réactions multiples (LC/MRM) et v) le profilage standard de l’ARNm. Ce flux de travail se prête aux faibles quantités de tissus obtenues par l’échantillonnage des sous-régions cérébrales fonctionnellement discrètes (c’est-à-dire par poinçonnage du cerveau), empêchant ainsi les biais dans l’analyse multimoléculaire dus à l’hétérogénéité tissulaire et / ou à la variabilité animale. Pour révéler les conséquences périphériques des maladies neurologiques et établir des lectures moléculaires translationnelles des états de maladie neurologique, l’échantillonnage et le traitement des organes périphériques et leur analyse lipidomique ultérieure, ainsi que la lipidomique plasmatique, sont également poursuivis et décrits. Le protocole est démontré sur un modèle murin d’épilepsie aiguë.
Introduction
Les progrès récents dans la fonction des lipides et leur rôle dans l’apparition et la progression des maladies neurologiques ouvrent de nouveaux lieux de recherche et de développement de nouvelles cibles thérapeutiques et d’élucidation des mécanismes de la maladie1. Les différences documentées dans la composition lipidique dans différentes régions du cerveau, soulignées par les techniques modernes d’imagerie moléculaire telles que l’imagerie par spectrométrie de masse et le profilage avancé par spectrométrie de masse, déplacent le paradigme de l’investigation des lipides de l’ensemble du cerveau vers des régions cérébrales fonctionnellement distinctes et discrètes. Le fait que la composition lipidique varie dans différentes régions du cerveau incite à une nouvelle conceptualisation de la sensibilité aux lipides membranaires et de la signalisation lipidique en aval en réponse à une insulte cérébrale ou à des stimuli dans les régions cérébrales fonctionnellement distinctes. Par conséquent, les protocoles lipidiques nécessitent de nouveaux développements pour relever le défi des faibles quantités de tissus pour la détection et la quantification à plus haute résolution spatiale, et simultanément, l’analyse de multiples composants lipidiques des membranes cellulaires et des voies de signalisation. En outre, la détermination des enzymes, des ligands lipidiques et des récepteurs impliqués dans la régulation de leurs niveaux et de leur fonction est primordiale pour élucider les voies de signalisation affectées dans une maladie neurologique et guider de nouvelles investigations mécanistes dans un contexte physiopathologique.
En plus de l’augmentation de la résolution spatiale du cerveau, deux difficultés majeures remettent en question le développement de nouvelles approches neurolipidomiques. Tout d’abord, les molécules de signalisation lipidique sont généralement de très faible abondance par rapport aux lipides constitutifs de la membrane. Deuxièmement, le lipidome présente une grande hétérogénéité structurelle, difficile à disséquer à l’aide d’une seule approche analytique. Par conséquent, les méthodes d’extraction et d’analyse sont adaptées à différentes catégories de lipides et couramment effectuées dans des échantillons de tissus distincts.2. Méthodes lipidomiques Shotgun3 sont d’excellents outils pour révéler rapidement un large profil des lipides membranaires, tandis que la sensibilité et la sélectivité accrues offertes par les méthodes de spectrométrie de masse de découverte et de quantification ciblées sont capitalisées pour étudier les lipides de signalisation à faible abondance, y compris: i) les lipides inflammatoires et ii) les lipides impliqués dans la modulation de l’activité neuronale, tels que les endocannabinoïdes (eCB), les lipides liés aux acides aminés, etc.4,5. Pour englober les changements lipidiques à la fois au niveau de la membrane cellulaire et de la signalisation se produisant dans les régions du cerveau des modèles de maladies neurologiques, l’extraction et l’analyse des lipides sont généralement effectuées dans des échantillons de tissus distincts, obtenus à partir de lots animaux distincts ou de différents hémisphères, ou en disséquant une plus grande région tissulaire en plusieurs morceaux. Lorsque les niveaux d’ARNm des récepteurs enzymatiques sont également intéressants, leur étude nécessite généralement l’obtention d’un échantillon de tissu distinct. Par exemple, l’étude des lipides membranaires, des cannabinoïdes endogènes et de l’ARNm nécessiterait trois échantillons de tissus différents (par exemple, deux échantillons pour les deux méthodes d’extraction des lipides – lipides membranaires et lipides de signalisation – et deux méthodes d’analyse des lipides subséquentes – et un échantillon pour l’analyse de l’ARNm). L’étude des lipides inflammatoires et des cannabinoïdes endogènes nécessite respectivement deux échantillons de tissus, des méthodes d’extraction et des méthodes d’analyse distincts. Un autre exemple est l’étude de l’ARNm et de toute catégorie de lipides dans un échantillon de microdissection cérébrale ou laser qui nécessite par conséquent deux animaux distincts pour obtenir deux échantillons par (sous-)région cérébrale. Une variabilité importante et/ou une mauvaise reproductibilité des résultats se produisent fréquemment dans de tels cas, provenant de la variabilité biologique et/ou de l’hétérogénéité tissulaire. Guidé par ces limites pratiques de l’analyse multimoléculaire, se produisant en particulier à haute résolution spatiale dans le cerveau, un protocole neurolipidomique à trois modules a été conçu englobant: 1) la coextraction et la co-analyse par LC / MRM des lipides inflammatoires (par exemple, les eicosanoïdes (eiC)) et des lipides impliqués dans la modulation de l’activité neuronale, tels que les eCB2; 2) co-extraction des phospholipides (PL) et des eCB avec analyse LC/MRM multiscan et analyse de perte précurseur/neutre ultérieure2; et 3) double extraction des lipides membranaires (phospho)et des eCB ainsi que de l’ARNm, avec analyse ultérieure LC/MRM et qPCR ou séquençage de l’ARN6. Selon la question biologique à traiter dans une maladie neurologique et la région du cerveau d’intérêt, une combinaison du premier et du deuxième protocole, ou du premier et du troisième protocole, peut être appliquée sur le même échantillon de tissu pour des tissus pesant environ 4 mg. Les premier et troisième protocoles peuvent être appliqués indépendamment pour les tissus autour de 2 mg. Le deuxième protocole peut être appliqué pour les tissus pesant aussi peu que 0,5 mg. Quel que soit le module de protocole neurolipidomique sélectionné, le prélèvement tissulaire et le traitement pré-analytique, l’isolement cérébral et la dissection de la région, ainsi que la procédure de sacrifice du modèle animal sont standardisés et identiques pour les trois modules du protocole. Dans notre enquête sur les maladies neurologiques, les organes périphériques pertinents pour les conséquences pathologiques de la maladie sont toujours collectés et analysés à l’aide de ces protocoles modulaires. De plus, le sang est régulièrement prélevé pour la lipidomique plasmatique afin de servir d’outil de lecture des maladies neurologiques en vue d’applications translationnelles potentielles. Le protocole lipidomique modulaire présenté ici est très polyvalent : évolutif à de plus grandes quantités de tissus et facilement applicable à pratiquement tous les types de tissus et de maladies. Pour l’application du protocole modulaire (Graphique 1) dans les maladies neurologiques, tout modèle normalisé d’apparition et de progression de troubles neurologiques, tels que les lésions cérébrales traumatiques, la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer ou l’épilepsie, est acceptable.
Ces protocoles ont été largement appliqués pour étudier les changements dans le lipidome tissulaire et / ou le transcriptome à la phase aiguë de l’épilepsie dans le modèle murin d’épilepsie induit par l’acide kainique (KA)2,7, un modèle largement utilisé dans les études précliniques en raison de la ressemblance avec l’épilepsie du lobe temporal humain (TLE)8,9,10,11. À l’aide de ces protocoles, le potentiel thérapeutique de médicaments tels que le palmitoyléthanolamide (PEA)12,13 a été évalué dans le même modèle murin d’épilepsie. L’étude a identifié des changements de lipides et d’ARNm à haute et basse résolution spatiale dans le cerveau et la périphérie, au point temporel des intensités de crise aiguës maximales (à 60 min après l’induction de l’incendie), et lors d’un traitement subchronique et aigu avec PEA à quatre moments différents (20, 60, 120 et 180 min) après l’induction de la crise KA, une fenêtre temporelle couvrant la phase aiguë de l’épilepsie. Le plasma, le cerveau et les organes périphériques de souris injectées de KA non traitées, de souris traitées au PEA aigu et subchroniquement, ainsi que de souris témoins de véhicules et de véhicules PEA, ont été collectés à chaque point de temps12,13 et étudiés avec cette analyse moléculaire. Les données moléculaires ont été corrélées avec les phénotypes comportementaux obtenus par scoring de crise, ainsi qu’avec les données dérivées de l’immunohistochimie sur les processus neurodégénératifs, afin de démêler la progression de la phase d’épilepsie aiguë et le potentiel du PEA pour l’atténuer.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthodologie neurolipidomique et transcriptomique décrite ici est un moyen viable d’étudier toute maladie ou développement sain à haute et basse résolution spatiale dans le cerveau et les organes périphériques. Grâce aux procédures optimisées d’échantillonnage et de manipulation du plasma, l’analyse lipidomique plasmatique peut également être effectuée à partir des mêmes animaux sacrifiés pour la lipidomique tissulaire et la transcriptomique, améliorant ainsi la fiabilité des corrélats molé…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous dédions cet article au Dr Ermelinda Lomazzo. Lors de la finalisation de ce manuscrit, le Dr Ermelinda Lomazzo est décédée. Elle est l’incarnation de la passion pour la science et de l’engagement désintéressé dans le travail d’équipe pour atteindre un objectif de recherche significatif. Elle a toujours rêvé de contribuer de manière significative au plus grand bien-être des humains. Sa nature bienveillante n’a jamais été compromise par les routes pénibles de la science et de la vie. Elle restera inestimable, et pour toujours, dans nos cœurs.
Julia M. Post a été financée par le programme Focus pour les neurosciences translationnelles (FTN) au Centre médical universitaire de l’Université Johannes Gutenberg de Mayence et est actuellement financée par le projet SPP-2225 EXIT à LB. Raissa Lerner a été partiellement financée par le projet DZHK 81X2600250 à LB et Lipidomics Core Facility. Un financement partiel pour ces études a été fourni par le Lipidomics Core Facility, l’Institut de chimie physiologique et des fonds intra-muros (à LB) du Centre médical universitaire de l’Université Johannes Gutenberg de Mayence.
Materials
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
| ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
| Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
| Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
| Bino | Zeiss | Microscopy | |
| cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
| Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
| CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
| EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
| Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
| Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
| Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
| Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
| Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
| Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
| LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
| Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
| Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
| Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| Motic Camara | Motic | Microscopy | |
| MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
| MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
| PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
| PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
| PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
| PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
| Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
| Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
| Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
| Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
| PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
| Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
| Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
| Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
| Rneasy Mini Kit – RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
| Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
| Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
| SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
| SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
| Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
| Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
| T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
| Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
| Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
| Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |
References
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