Lipidomik und Transkriptomik bei neurologischen Erkrankungen
Summary
Dieser Artikel stellt ein modulares Protokoll für Gewebelipidomik und Transkriptomik sowie Plasmalipidomik in Mausmodellen für neurologische Erkrankungen vor, die auf Lipide abzielen, die Entzündungen und neuronaler Aktivität zugrunde liegen, Membranlipide, nachgeschaltete Botenstoffe und mRNA-kodierende Enzyme / Rezeptoren, die der Lipidfunktion zugrunde liegen. Probenahme-, Probenverarbeitungs-, Extraktions- und Quantifizierungsverfahren werden beschrieben.
Abstract
Lipide dienen als primäre Schnittstelle zu Hirnverletzungen oder Reizen, die neurologischen Erkrankungen förderlich sind, und sind ein Reservoir für die Synthese von Lipiden mit verschiedenen Signal- oder Ligandenfunktionen, die den Beginn und das Fortschreiten von Krankheiten unterstreichen können. Lipide, die sich oft auf präsymptomatischer Ebene verändern, sind eine aufstrebende Quelle für Wirkstoffziele und Biomarker. Viele neurologische Erkrankungen weisen Neuroinflammation, Neurodegeneration und neuronale Erregbarkeit als häufige Kennzeichen auf, die teilweise durch spezifische Lipidsignalsysteme moduliert werden. Die Interdependenz und Wechselbeziehung der Synthese verschiedener Lipide führt zu einer Multilipid-, Multienzym- und Multirezeptoranalyse, um die Gemeinsamkeiten und Besonderheiten neurologischer Kontexte abzuleiten und die Entschlüsselung mechanistischer Aspekte des Krankheitsbeginns und -verlaufs zu beschleunigen. Die Zuschreibung von Lipidrollen an verschiedene Hirnregionen fördert die Bestimmung des molekularen Lipidphänotyps und der Morphologie im Zusammenhang mit einer neurologischen Erkrankung.
Hier wird ein modulares Protokoll vorgestellt, das für die Analyse von Membranlipiden und nachgeschalteten Lipidsignalen zusammen mit mRNA von Enzymen und Mediatoren, die ihrer Funktionalität zugrunde liegen, aus diskreten Hirnregionen extrahiert wird, die für eine bestimmte neurologische Erkrankung und / oder Erkrankung relevant sind. Um ein genaues vergleichendes lipidomisches Profiling zu gewährleisten, wurden die Arbeitsabläufe und Betriebskriterien optimiert und standardisiert für: i) Gehirnprobenahme und Dissektion von Regionen von Interesse, ii) Co-Extraktion mehrerer Lipidsignale und Membranlipide, iii) duale Lipid/mRNA-Extraktion, iv) Quantifizierung durch Flüssigkeitschromatographie Multiple Reaction Monitoring (LC/MRM) und v) Standard-mRNA-Profiling. Dieser Workflow ist für die geringen Gewebemengen geeignet, die durch die Probenahme der funktionell diskreten Hirnunterregionen (d.h. durch Hirnstanzen) erhalten werden, wodurch Verzerrungen in der multimolekularen Analyse aufgrund von Gewebeheterogenität und/oder Tiervariabilität verhindert werden. Um periphere Konsequenzen neurologischer Erkrankungen aufzudecken und translationale molekulare Auslesungen neurologischer Krankheitszustände zu etablieren, werden auch periphere Organentnahmen, -verarbeitungen und deren anschließende lipidomische Analyse sowie Plasmalipidomik verfolgt und beschrieben. Das Protokoll wird an einem Mausmodell für akute Epilepsie demonstriert.
Introduction
Jüngste Fortschritte in der Funktion von Lipiden und ihrer Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten neurologischer Erkrankungen eröffnen neue Forschungs- und Entwicklungsmöglichkeiten für neue therapeutische Ziele und die Aufklärung von Krankheitsmechanismen1. Dokumentierte Unterschiede in der Lipidzusammensetzung in verschiedenen Hirnregionen, die durch moderne molekulare Bildgebungsverfahren wie Massenspektrometrie-Bildgebung und fortschrittliche Massenspektrometrie-Profilierung betont werden, verschieben das Paradigma der Lipiduntersuchung vom gesamten Gehirn hin zu funktionell unterschiedlichen und diskreten Hirnregionen. Die Tatsache, dass die Lipidzusammensetzung in verschiedenen Gehirnregionen variiert, führt zu einer neuen Konzeptualisierung sowohl der Membranlipidempfindlichkeit als auch der nachgeschalteten Lipidsignalisierung als Reaktion auf eine Hirnverletzung oder -reize in den funktionell unterschiedlichen Hirnregionen. Daher erfordern Lipidprotokolle neue Entwicklungen, um die Herausforderung niedriger Gewebemengen für die Erkennung und Quantifizierung mit höherer räumlicher Auflösung und gleichzeitig die Analyse mehrerer Lipidkomponenten von Zellmembranen und Signalwegen zu bewältigen. Auch die Bestimmung von Enzymen, Lipidliganden und Rezeptoren, die an der Regulation ihrer Spiegel und Funktion beteiligt sind, ist von größter Bedeutung, um die bei einer neurologischen Erkrankung betroffenen Signalwege aufzuklären und neue mechanistische Untersuchungen in einem pathophysiologischen Kontext zu leiten.
Neben der erhöhten räumlichen Auflösung des Gehirns gibt es zwei große Schwierigkeiten, die die Entwicklung neuer neurolipidomischer Ansätze herausfordern. Erstens sind die Lipidsignalmoleküle im Vergleich zu membrankonstitutiven Lipiden typischerweise von sehr geringer Häufigkeit. Zweitens weist das Lipidom eine hohe strukturelle Heterogenität auf, die mit einem einzigen analytischen Ansatz schwer zu sezieren ist. Daher sind Extraktions- und Analysemethoden auf verschiedene Lipidkategorien zugeschnitten und werden üblicherweise in verschiedenen Gewebeproben durchgeführt.2. Shotgun lipidomische Methoden3 sind ausgezeichnete Werkzeuge, um schnell ein breites Profil von Membranlipiden aufzudecken, während eine erhöhte Empfindlichkeit und Selektivität, die durch die gezielte Entdeckung und Quantifizierung von massenspektrometrischen Methoden ermöglicht wird, für die Untersuchung von Signallipiden mit geringer Häufigkeit genutzt werden, darunter: i) Entzündungslipide und ii) Lipide, die an der Modulation der neuronalen Aktivität beteiligt sind, wie Endocannabinoide (eCBs), Aminosäure-verknüpfte Lipide, etc.4,5. Um Lipidveränderungen sowohl auf Zellmembran- als auch auf Signalebene zu erfassen, die in Gehirnregionen neurologischer Krankheitsmodelle auftreten, werden die Lipidextraktion und -analyse typischerweise in verschiedenen Gewebeproben durchgeführt, die aus verschiedenen Tierchargen oder aus verschiedenen Hemisphären gewonnen werden, oder indem eine größere Geweberegion in mehrere Stücke zerlegt wird. Wenn auch die mRNA-Spiegel von Enzymrezeptoren von Interesse sind, erfordert ihre Untersuchung typischerweise die Beschaffung einer eindeutigen Gewebeprobe. Zum Beispiel würde die Untersuchung von Membranlipiden, endogenen Cannabinoiden und mRNA drei verschiedene Gewebeproben erfordern (z. B. zwei Proben für die beiden Lipidextraktionsmethoden – Membranlipide und Signallipide – und anschließend zwei Lipidanalysemethoden – und eine Probe für die mRNA-Analyse). Die Untersuchung von Entzündungslipiden und endogenen Cannabinoiden erfordert zwei verschiedene Gewebeproben, Extraktionsmethoden bzw. Analysemethoden. Ein weiteres Beispiel ist die Untersuchung von mRNA und jeder Lipidkategorie in einer Gehirnstanz- oder Laser-Mikrodissektionsprobe, die folglich zwei verschiedene Tiere benötigt, um zwei Proben pro Gehirn(sub)region zu beschaffen. In solchen Fällen tritt häufig ein erhebliches Maß an Variabilität und/oder schlechter Reproduzierbarkeit der Ergebnisse auf, das auf biologische Variabilität und/oder Gewebeheterogenität zurückzuführen ist. Geleitet von diesen praktischen Einschränkungen der multimolekularen Analyse, die insbesondere bei hoher räumlicher Auflösung im Gehirn auftritt, wurde ein dreimoduliges Neurolipidomik-Protokoll entwickelt, das Folgendes umfasst: 1) Koextraktion und Co-Analyse durch LC / MRM von entzündlichen Lipiden (z. B. Eicosanoide (EiCs)) und Lipiden, die an der Modulation der neuronalen Aktivität beteiligt sind, wie z. B. eCBs2; 2) Co-Extraktion von Phospholipiden (PLs) und eCBs mit anschließender Multiscan LC/MRM und Precursor/Neutral Loss Scan Analyse2; und 3) duale Extraktion von Membran(phospho)lipiden und eCBs sowie mRNA, mit anschließender LC/MRM- und qPCR- oder RNA-Sequenzierungsanalyse6. Abhängig von der biologischen Fragestellung, die bei einer neurologischen Erkrankung behandelt werden soll, und der interessierenden Hirnregion kann eine Kombination aus dem ersten und dem zweiten Protokoll oder dem ersten und dritten Protokoll auf dieselbe Gewebeprobe für Gewebe mit einem Gewicht von etwa 4 mg angewendet werden. Das erste und dritte Protokoll können unabhängig voneinander für Gewebe um 2 mg angewendet werden. Das zweite Protokoll kann für Gewebe mit einem Gewicht von nur 0,5 mg angewendet werden. Unabhängig vom gewählten neurolipidomischen Protokollmodul sind die Gewebeentnahme und präanalytische Verarbeitung, die Hirnisolation und Regionsektion sowie das Verfahren zur Opferung des Tiermodells für alle drei Module des Protokolls standardisiert und identisch. Bei unserer Untersuchung neurologischer Erkrankungen werden mit diesen modularen Protokollen immer auch periphere Organe, die für die pathologischen Folgen der Erkrankung relevant sind, gesammelt und analysiert. Darüber hinaus wird regelmäßig Blut für die Plasmalipidomik entnommen, um als Auslesewerkzeug für neurologische Erkrankungen mit Blick auf prospektive translationale Anwendungen zu dienen. Das hier vorgestellte modulare Lipidomik-Protokoll ist sehr vielseitig: skalierbar auf größere Gewebemengen und leicht anwendbar für praktisch jeden Gewebetyp und jede Krankheit. Für die Anwendung des modularen Protokolls (Abbildung 1) bei neurologischen Erkrankungen ist jedes standardisierte Nagetiermodell für den Beginn und das Fortschreiten neurologischer Störungen wie Schädel-Hirn-Trauma, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit oder Epilepsie zugänglich.
Diese Protokolle wurden umfassend angewendet, um Veränderungen des Gewebelipidoms und/oder Transkriptoms in der akuten Phase der Epilepsie im Kainsäure (KA)-induzierten Mausmodell der Epilepsie zu untersuchen2,7, einem Modell, das in präklinischen Studien aufgrund der Ähnlichkeit mit der menschlichen Temporallappenepilepsie (TLE) häufig verwendet wird 8,9,10,11. Unter Verwendung dieser Protokolle wurde das therapeutische Potenzial von Arzneimitteln wie Palmitoylethanolamid (PEA)12,13 im selben Mausmodell für Epilepsie untersucht. Die Studie identifizierte Lipid- und mRNA-Veränderungen mit hoher und niedriger räumlicher Auflösung im Gehirn und in der Peripherie, zum Zeitpunkt der maximalen akuten Anfallsintensitäten (bei 60 Minuten posteizürischer Induktion) und bei subchronischer und akuter Behandlung mit PEA zu vier verschiedenen Zeitpunkten (20, 60, 120 und 180 min) nach der KA-Anfallsinduktion, einem Zeitfenster, das die akute Phase der Epilepsie abdeckt. Plasma, Gehirne und periphere Organe von unbehandelten KA-injizierten Mäusen, akuten und subchron PEA-behandelten Mäusen sowie Vehikel- und PEA-Vehikel-Kontrollmäusen wurden zu jedem Zeitpunkt gesammelt12,13 und mit dieser molekularen Analyse untersucht. Die molekularen Daten korrelierten mit Verhaltensphänotypen, die durch Anfallsbewertung erhalten wurden, sowie mit immunhistochemisch abgeleiteten Daten zu neurodegenerativen Prozessen, um das Fortschreiten der akuten Epilepsiephase und das Potenzial von PEA, sie zu lindern, zu entschlüsseln.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene neurolipidomische und transkriptomische Methodik ist ein praktikables Mittel, um jede Krankheit oder gesunde Entwicklung bei hoher und niedriger räumlicher Auflösung im Gehirn und in peripheren Organen zu untersuchen. Aufgrund der optimierten Plasmaprobenahme- und Handhabungsverfahren kann die Plasmalipidomanalyse auch von denselben Tieren durchgeführt werden, die für die Gewebelipidomik und Transkriptomik geopfert wurden, wodurch die Zuverlässigkeit der molekularen Korrelate von Gewebeblut und…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir widmen diesen Artikel Dr. Ermelinda Lomazzo. Während der Fertigstellung dieses Manuskripts verstarb Dr. Ermelinda Lomazzo. Sie ist die Verkörperung der Leidenschaft für die Wissenschaft und des selbstlosen Engagements in der Teamarbeit, um einen sinnvollen Forschungszweck zu erfüllen. Sie träumte immer davon, einen sinnvollen Beitrag zum größeren Wohlergehen der Menschen zu leisten. Ihre gutherzige Natur wurde nie durch die anstrengenden Wege der Wissenschaft und des Lebens beeinträchtigt. Sie wird von unschätzbarem Wert und für immer in unseren Herzen bleiben.
Julia M. Post wurde durch das Focus Program for Translational Neuroscience (FTN) an der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz gefördert und wird derzeit durch das SPP-2225 EXIT Projekt an LB gefördert. Raissa Lerner wurde teilweise durch das DZHK-Projekt 81X2600250 an LB und Lipidomics Core Facility gefördert. Eine Teilfinanzierung dieser Studien erfolgte durch die Lipidomics Core Facility, das Institut für Physiologische Chemie und Intramurale Mittel (an LB) der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz.
Materials
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
| ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
| Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
| Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
| Bino | Zeiss | Microscopy | |
| cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
| Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
| CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
| EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
| Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
| Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
| Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
| Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
| Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
| Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
| LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
| Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
| Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
| Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| Motic Camara | Motic | Microscopy | |
| MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
| MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
| PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
| PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
| PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
| PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
| Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
| Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
| Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
| Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
| PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
| Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
| Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
| Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
| Rneasy Mini Kit – RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
| Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
| Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
| SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
| SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
| Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
| Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
| T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
| Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
| Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
| Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |
References
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