Липидомика и транскриптомика при неврологических заболеваниях
Summary
В этой статье представлен модульный протокол для тканевой липидомики и транскриптомики, а также плазменной липидомики в моделях неврологических заболеваний мышей, нацеленных на липиды, лежащие в основе воспаления и активности нейронов, мембранные липиды, последующие мессенджеры и ферменты / рецепторы, кодирующие мРНК, лежащие в основе липидной функции. Описаны процедуры отбора проб, обработки проб, извлечения и количественной оценки.
Abstract
Липиды служат основным интерфейсом для мозговых оскорблений или стимулов, способствующих неврологическим заболеваниям, и являются резервуаром для синтеза липидов с различными сигнальными или лигандными функциями, которые могут подчеркивать возникновение и прогрессирование заболеваний. Часто изменяясь на предсимптомном уровне, липиды являются новым источником лекарственных мишеней и биомаркеров. Многие неврологические заболевания проявляют нейровоспаление, нейродегенерацию и возбудимость нейронов в качестве общих признаков, частично модулированных специфическими липидными сигнальными системами. Взаимозависимость и взаимосвязь синтеза различных липидов побуждает к многолипидному, мультиферментному и мультирецепторному анализу с целью выявления общих и специфических особенностей неврологических контекстов и ускорения разгадки механистических аспектов возникновения и прогрессирования заболевания. Приписывание липидных ролей различным областям мозга способствует определению молекулярного фенотипа липидов и морфологии, связанных с неврологическим заболеванием.
Представленный здесь модульный протокол, подходящий для анализа мембранных липидов и последующих липидных сигналов вместе с мРНК ферментов и медиаторов, лежащих в основе их функциональности, извлеченных из дискретных областей мозга, которые имеют отношение к конкретному неврологическому заболеванию и / или состоянию. Для обеспечения точного сравнительного липидомного профилирования рабочие процессы и критерии работы были оптимизированы и стандартизированы для: i) отбора проб мозга и рассечения областей, представляющих интерес, ii) совместной экстракции нескольких липидных сигналов и мембранных липидов, iii) двойной экстракции липидов / мРНК, iv) количественной оценки с помощью мониторинга множественных реакций жидкостной хроматографии (LC / MRM) и v) стандартного профилирования мРНК. Этот рабочий процесс поддается малым количествам тканей, полученным путем отбора проб функционально дискретных субрегионов мозга (т.е. путем ударов мозга), что предотвращает смещение в многомолекулярном анализе из-за неоднородности тканей и / или изменчивости животных. Для выявления периферических последствий неврологических заболеваний и установления трансляционных молекулярных показаний неврологических болезненных состояний также проводится и описывается забор проб периферических органов, обработка и их последующий липидомический анализ, а также липидомика плазмы. Протокол демонстрируется на мышиной модели острой эпилепсии.
Introduction
Последние достижения в области функции липидов и их роли в возникновении и прогрессировании неврологических заболеваний открывают новые научно-исследовательские и опытно-конструкторские площадки для новых терапевтических мишеней и выяснения механизмов заболевания1. Задокументированные различия в липидном составе в разных областях мозга, подчеркнутые современными методами молекулярной визуализации, такими как масс-спектрометрическая визуализация и расширенное профилирование масс-спектрометрии, смещают парадигму исследования липидов от всего мозга к функционально различным и дискретным областям мозга. Тот факт, что липидный состав варьируется в разных областях мозга, вызывает новую концептуализацию как мембранной липидной чувствительности, так и последующей липидной сигнализации в ответ на повреждение мозга или стимулы в функционально различных областях мозга. Следовательно, липидные протоколы требуют новых разработок для решения проблемы низких количеств тканей для обнаружения и количественной оценки с более высоким пространственным разрешением и одновременно анализа нескольких липидных компонентов клеточных мембран и сигнальных путей. Кроме того, определение ферментов, липидных лигандов и рецепторов, участвующих в регуляции их уровней и функций, имеет первостепенное значение для выяснения сигнальных путей, затронутых неврологическим заболеванием, и руководства новыми механистическими исследованиями в патофизиологическом контексте.
В дополнение к увеличению пространственного разрешения мозга, существуют две основные трудности, бросающие вызов разработке новых нейролипидомных подходов. Во-первых, липидные сигнальные молекулы, как правило, имеют очень низкое содержание по сравнению с мембранными конститутивными липидами. Во-вторых, липидом проявляет высокую структурную гетерогенность, которую трудно препарировать с помощью одного аналитического подхода. Следовательно, методы экстракции и анализа адаптированы к различным категориям липидов и обычно выполняются в разных образцах тканей.2. Липидомические методы дробовика3 являются отличными инструментами для быстрого выявления широкого профиля мембранных липидов, в то время как повышенная чувствительность и селективность, обеспечиваемые целенаправленными методами открытия и количественной оценки масс-спектрометрических методов, используются для исследования низкообильных сигнальных липидов, включая: i) воспалительные липиды и ii) липиды, участвующие в модуляции нейрональной активности, такие как эндоканнабиноиды (eCB), аминокислотно-связанные липиды, и так далее.4,5. Чтобы охватить изменения липидов как на клеточной мембране, так и на уровне сигнализации, происходящие в областях мозга моделей неврологических заболеваний, обычно экстракция и анализ липидов проводятся в отдельных образцах тканей, полученных из различных партий животных или из разных полушарий, или путем рассечения более крупной области ткани на несколько частей. Когда уровни мРНК ферментных рецепторов также представляют интерес, их исследование обычно требует получения отдельного образца ткани. Например, исследование мембранных липидов, эндогенных каннабиноидов и мРНК потребует трех различных образцов тканей (например, двух образцов для двух методов экстракции липидов – мембранных липидов и сигнальных липидов – и последующих двух методов анализа липидов – и одного образца для анализа мРНК). Исследование воспалительных липидов и эндогенных каннабиноидов требует двух различных образцов тканей, методов экстракции и методов анализа, соответственно. Другим примером является исследование мРНК и любой липидной категории в образце мозгового пунша или лазерной микродиссекции, что, следовательно, требует, чтобы два разных животных получали два образца на (под)область мозга. В таких случаях часто наблюдается значительная степень изменчивости и/или плохой воспроизводимости результатов, обусловленная биологической изменчивостью и/или неоднородностью тканей. Руководствуясь этими практическими ограничениями многомолекулярного анализа, происходящими, в частности, при высоком пространственном разрешении в головном мозге, был разработан трехмодульный протокол нейролипидомики, охватывающий: 1) коэкстракцию и совместный анализ LC / MRM воспалительных липидов (например, эйкозаноидов (EIC)) и липидов, участвующих в модуляции нейронной активности, таких как eCB2; 2) совместная экстракция фосфолипидов (ПЛ) и eCB с последующим мультисканированием LC/MRM и прекурсором/нейтральным анализом потерь2; и 3) двойная экстракция мембранных (фосфо)липидов и eCB, а также мРНК с последующим анализом секвенирования LC/MRM и qPCR или РНК6. В зависимости от биологического вопроса, подлежащего решению при неврологическом заболевании и интересующей области мозга, комбинация первого и второго протокола или первого и третьего протокола может быть применена к одному и тому же образцу ткани для тканей весом около 4 мг. Первый и третий протоколы могут быть независимо применены для тканей около 2 мг. Второй протокол может быть применен для тканей весом всего 0,5 мг. Независимо от выбранного модуля нейролипидомного протокола, забор тканей и преаналитическая обработка, выделение мозга и рассечение области, а также процедура жертвоприношения животной модели стандартизированы и идентичны для всех трех модулей протокола. В нашем исследовании неврологических заболеваний периферические органы, которые имеют отношение к патологическим последствиям заболевания, всегда также собираются и анализируются с использованием этих модульных протоколов. Кроме того, кровь регулярно отбирается для плазменной липидомики, чтобы служить инструментом считывания неврологических заболеваний с целью перспективного трансляционного применения. Представленный здесь модульный протокол липидомики очень универсален: масштабируется до больших количеств тканей и легко применим практически для любого типа тканей и заболевания. Для применения модульного протокола (Рисунок 1) при неврологических заболеваниях любая стандартизированная модель грызунов начала и прогрессирования неврологических расстройств, таких как черепно-мозговая травма, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера или эпилепсия, поддаются лечению.
Эти протоколы широко применялись для изучения изменений в тканевом липидоме и/или транскриптоме в острой фазе эпилепсии в мышиной модели эпилепсии, индуцированной кайновой кислотой (КА)2,7, модели, широко используемой в доклинических исследованиях из-за сходства с эпилепсией височной доли человека (TLE)8,9,10,11. Используя эти протоколы, терапевтический потенциал таких препаратов, как Пальмитоилэтаноламид (ПЭА)12,13, оценивали в той же мышиной модели эпилепсии. Исследование выявило изменения липидов и мРНК при высоком и низком пространственном разрешении в мозге и периферии, в точке максимальной интенсивности острых приступов (при 60 мин после индукции после захвата) и при субхроническом и остром лечении ПЭА в четырех различных временных точках (20, 60, 120 и 180 мин) после индукции KA-припадка, временное окно, охватывающее острую фазу эпилепсии. Плазма, мозг и периферические органы необработанных мышей, введенных к КА, острых и субхронически обработанных ПЭА мышей, а также контрольных мышей с транспортным средством и ПЭА-транспортным средством, были собраны в каждый момент времени12,13 и исследованы с помощью этого молекулярного анализа. Молекулярные данные коррелировали с поведенческими фенотипами, полученными с помощью оценки судорог, а также с данными иммуногистохимии о нейродегенеративных процессах, чтобы разгадать прогрессирование фазы острой эпилепсии и потенциал ПЭА для ее облегчения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Нейролипидомная и транскриптомная методология, описанная здесь, является жизнеспособным средством для исследования любого заболевания или здорового развития при высоком и низком пространственном разрешении в мозге и периферических органах. Благодаря оптимизированному отбору обра?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы посвящаем эту статью доктору Эрмелинде Ломаццо. Во время завершения этой рукописи доктор Эрмелинда Ломаццо скончалась. Она является воплощением страсти к науке и самоотверженного участия в командной работе для выполнения значимой исследовательской цели. Она всегда мечтала внести значимый вклад в большее благосостояние людей. Ее добросердечная натура никогда не была скомпрометирована напряженными дорогами науки и жизни. Она останется бесценной и навсегда в наших сердцах.
Джулия М. Пост финансировалась Программой фокусировки по трансляционной неврологии (FTN) в Университетском медицинском центре Университета Иоганна Гутенберга в Майнце и в настоящее время финансируется проектом SPP-2225 EXIT для LB. Раиса Лернер частично финансировалась проектом DZHK 81X2600250 для LB и Lipidomics Core Facility. Частичное финансирование этих исследований было предоставлено Основным центром липидомики, Институтом физиологической химии и очными фондами (для LB) из Университетского медицинского центра Университета Иоганна Гутенберга в Майнце.
Materials
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
| ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
| Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
| Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
| Bino | Zeiss | Microscopy | |
| cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
| Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
| CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
| EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
| Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
| Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
| Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
| Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
| Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
| Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
| LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
| Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
| Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
| Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| Motic Camara | Motic | Microscopy | |
| MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
| MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
| PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
| PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
| PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
| PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
| Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
| Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
| Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
| Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
| PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
| Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
| Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
| Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
| Rneasy Mini Kit – RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
| Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
| Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
| SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
| SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
| Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
| Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
| T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
| Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
| Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
| Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |
References
- Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
- Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).
- Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
- Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).
- Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).
- Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).
- Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).
- Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).
- Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J. Microglia-Neuron Communication in Epilepsy. Glia. 65 (1), 5-18 (2017).
- Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079 (2011).
- Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. Role of α-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice. Peptides. 44, 158-162 (2013).
- Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice. Frontiers in Neuroscience. 13, 527 (2019).
- Post, J. M., et al. Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).
- Schauwecker, P. E., Steward, O. Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).
- Monory, K., et al. The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus. Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).
- Konsman, J. P. The mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).
- Spijker, S., Li, K. W. Dissection of Rondent Brain Regions. Neuroproteomics. 57, 13-27 (2011).
- Gross, R. W. The evolution of lipidomics through space and time. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Abbott, S. K., et al. An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids. Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).
- Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).
