Изоляция, Культура, Характеристика и Дифференциация клеток-прародителей мышц человека от процедуры биопсии скелетных мышц

Summary

Мы представляем методы изоляции, культивирования, характеристики и дифференциации клеток-прародителей мышц человека (HMPCs), полученных из скелетной мышечной биопсии ткани. hMPCs, полученные и характеризуемые с помощью этих методов, могут быть использованы для последующего решения вопросов, связанных с исследованиями, связанными с миогенезом человека и регенерацией скелетных мышц.

Abstract

Использование первичных тканей и клеток человека идеально подходит для исследования биологических и физиологических процессов, таких как регенеративный процесс скелетных мышц. Существуют признанные проблемы для работы с человеческими первичными взрослыми стволовыми клетками, особенно клетками-потомками человеческих мышц (HMPCs), полученными в результате биопсии скелетных мышц, включая низкую урожайность клеток из собранной ткани и большую степень неоднородности донора параметров роста и смертности между культурами. Хотя включение неоднородности в экспериментальную конструкцию требует большего размера выборки для обнаружения значительных эффектов, это также позволяет нам определить механизмы, которые лежат в основе изменчивости потенциала расширения HMPC, и, таким образом, позволяет нам лучше понять неоднородность в регенерации скелетных мышц. Новые механизмы, которые отличают расширение способности культур имеют потенциал, чтобы привести к развитию терапии для улучшения регенерации скелетных мышц.

Introduction

Скелетная мышца является крупнейшей органной системой в организме человека, накоторую приходится 30–40% массы всего тела 1. В дополнение к своей хорошо признанной роли в передвижении, скелетные мышцы поддерживает температуру тела и осанку, и играет центральную роль во всем теле питательных гомеостаза. Исследования с участием человеческих участников, животных и моделей клеточной культуры являются ценными для решения вопросов, касающихся биологии скелетных мышц и регенерации. Изоляция и культура клеток-прародителей мышц человека (HMPCs) обеспечивает надежную модель, которая позволяет использовать методы клеточной культуры и манипуляции в образцах человека. Преимущество использования HMPCs является то, что они сохраняют генетический и метаболический фенотип от каждого донора^2,3. Поддержание донорского фенотипа позволяет исследователям исследовать межиндивидуальные различия в миогенном процессе. Например, мы использовали наш метод характеристикhMPC для выявления возрастных и половыхразличий в емкости расширения популяции hMPC 4.

Цель юма этого протокола состоит в том, чтобы подробно методы изолировать, культуры, охарактеризовать и дифференцировать HMPCs от скелетной мышечной биопсии ткани. Опираясь на предыдущую работу, которая описала HMPCs и определилпотенциальных создателей поверхности клеток для изоляции hMPC^5,6, этот протокол заполняет критический пробел в знаниях, связывая изоляцию с характеристикой HMPCs. Кроме того, подробные пошаговые инструкции, включенные в этот протокол, делают изоляцию и характеристики hMPC доступными для широкой научной аудитории, в том числе с ограниченным опытом работы с ГМпС. Наш протокол является одним из первых, чтобы описать использование цитометра изображений для отслеживания популяций клеток. Недавно разработанные цитометры визуализации являются самыми современными, высокопроизводительными и микроплитными, что позволяет в течение нескольких минут анализировать живые клетки, подсчет клеток и многоканальный анализ флуоресценции всех клеток в каждой скважине сосуда культуры. Эта система позволяет быстро количественно измерять динамические изменения в пролинизации и жизнеспособности всей популяции клеток с минимальным нарушением культуры. Например, мы можем выполнять объективные показатели слияния в последующие дни в пробирке, чтобы определить кинетику роста каждой культуры, полученной от различных доноров. Многие протоколы в литературе, особенно те, с участием дифференциации ПДК, требуют клетки для достижения определенного уровня слияния до начала дифференциации или лечения⁷. Наш метод позволяет объективно определить слияние каждой скважины в сосуде культуры, что позволяет исследователям инициировать лечение беспристрастным, несубъективным образом.

В прошлом основным ограничением использования первичных ГМпС были низкие урожаи, ограничивающие количество клеток, доступных для экспериментов. Мы и другие показали, что выход ПДК из ткани биопсии скелетных мышц составляет 1–15 ПДК на миллиграмм ткани(рисунок 1)⁸. Поскольку наш протокол позволяет четыре прохода клеток до очистки с флуоресценцией активированной сортировки клеток (FACS), наши криоконсервированные урожаи hMPC, полученные из небольших количеств биопсии ткани (50-100 мг), достаточно для решения исследовательских целей, где требуется несколько экспериментов. Наш протокол FACS производит 80% чистой (Pax7 положительный) MPC населения, таким образом, наш протокол оптимизирован как для урожайности и чистоты.

Protocol

Этот протокол был одобрен Институциональным наблюдательным советом Корнельского университета. Все участники были проверены на основные состояния здоровья и дали информированное согласие. 1. Получение мышечной ткани человека через биопсию скелетных мышц Определи…

Representative Results

Представитель потока цитометрии результаты hMPC изоляции от мышечной ткани человека можно рассматривать на рисунке 1. hMPCs могут быть определены путем первого gating событий, основанных на боковой рассеяния и вперед рассеяния для устранения мертвых клеток ?…

Discussion

Первичные HMPCs являются важной исследовательской моделью, используемой для понимания биологии скелетных мышц и регенеративного процесса. Кроме того, HMPCs имеют потенциал для использования для терапии. Тем не менее, Есть признанные проблемы в использовании первичных HMPCs для исследований …

Materials

0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-Cl	Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate	VWR	664160	Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube	Falcon	352196	15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate	Grenier Bio-One	662 160	Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution	eBioscience	00-6993-50	Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16	BioLegend	303016	Conjugated antibody for FACS
Black 96-well cell culture plate	Grenier Bio-One	655079	96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S	Nexcelcom Bioscience		Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer	VWR	352350	Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail)	Corning	354236	Collagen for coating cell culture plates
Collagenase D	Roche	11 088 882 001	Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide	VWR	WN182	Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II	Sigma Life Sciences	D4693	A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder	Gibco	31600-034	Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	21600-010	PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate	J.T. Baker	4040-01	Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum	VWR	89510-186	Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12	Gibco	21700-026	Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum	Gibco	26-050-070	Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer	iNCyto	DHC-N0105	Used to count cells
Hibernate A	Gibco	A1247501	Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Life Technologies	H21492	DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P-4	Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer	Orflo	MXA006	Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes	Orflo	MXC002	Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter	Orflo		Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50062Z	Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159	BD Pharmingen	557747	Conjugated antibody for FACS
Penicillin/Streptomycin 100X Solution	Corning	30-002-CI	Antibiotics added to culture media
Propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566	DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor	Promega	G5071	Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Gibco	12648-010	Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3	Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes	VWR	60818-565	Tubes used for FACS
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42	Compensation beads fort calibrating flow FACS settings