Isolamento, cultura, caratterizzazione e differenziazione delle cellule del progenitore muscolare umano dalla procedura di biopsia muscolare scheletrica

Summary

Presentiamo tecniche per isolare, coltivare, caratterizzare e differenziare le cellule progenitrici muscolari primarie umane (hMMP) ottenute dal tessuto della biopsia muscolare scheletrica. Gli hMPC ottenuti e caratterizzati attraverso questi metodi possono essere utilizzati per affrontare successivamente le domande di ricerca relative alla miogenesi umana e alla rigenerazione muscolare scheletrica.

Abstract

L’uso di tessuti e cellule primarie è ideale per lo studio di processi biologici e fisiologici come il processo rigenerativo muscolare scheletrico. Ci sono sfide riconosciute nel lavorare con le cellule staminali adulte primarie umane, in particolare le cellule progenitrici del muscolo umano (hMC) derivate da biopsie muscolari scheletriche, tra cui un basso rendimento cellulare dal tessuto raccolto e un ampio grado di eterogeneità dei donatori parametri di crescita e di morte tra le culture. Pur incorporando l’eterogeneità nella progettazione sperimentale è necessaria una dimensione del campione più grande per rilevare effetti significativi, ci permette anche di identificare i meccanismi che sono alla base della variabilità nella capacità di espansione di hMPC, e quindi ci permette di comprendere meglio l’eterogeneità nella rigenerazione muscolare scheletrica. Nuovi meccanismi che distinguono la capacità di espansione delle colture hanno il potenziale per portare allo sviluppo di terapie per migliorare la rigenerazione muscolare scheletrica.

Introduction

Il muscolo scheletrico è il più grande sistema di organi nel corpo umano, che rappresenta il 30-40% di tutta la massa corporea¹. Oltre al suo ruolo ben riconosciuto nella locomozione, il muscolo scheletrico mantiene la temperatura corporea e la postura e svolge un ruolo centrale nell’omeostasi nutritiva di tutto il corpo. La ricerca che coinvolge partecipanti umani, animali e modelli di coltura cellulare sono tutti preziosi per affrontare le domande relative alla biologia muscolare scheletrica e alla rigenerazione. L’isolamento e la coltura delle cellule progenitrici muscolari primarie umane (hMCC) fornisce un modello robusto che consente di applicare tecniche e manipolazioni della coltura cellulare a campioni umani. Un vantaggio dell’uso di hMPC è che mantengono il fenotipo genetico e metabolico da ciascun donatore^2,3. La manutenzione del fenotipo del donatore consente ai ricercatori di esaminare la variazione inter-individuale nel processo miogenico. Ad esempio, abbiamo impiegato il nostro metodo di caratterizzazione hMPC per identificare le differenze legate all’età e al sesso nella capacità di espansione della popolazione di hMPC⁴.

Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere in dettaglio le tecniche per isolare, cultura, caratterizzare e differenziare gli HMP Dal tessuto della biopsia muscolare scheletrica. Basandosi su un lavoro precedente che descriveva gli HMPC e identificava i potenziali produttori di superfici cellulari per l’isolamento hMPC^5,6, questo protocollo colma una lacuna critica nella conoscenza collegando l’isolamento alla caratterizzazione degli hMPC. Inoltre, le istruzioni dettagliate fornite in questo protocollo rendono l’isolamento e la caratterizzazione hMPC accessibili a un vasto pubblico scientifico, comprese quelle con un’esperienza precedente limitata con gli HMPC. Il nostro protocollo è tra i primi a descrivere l’uso di un citometro di imaging per tracciare le popolazioni cellulari. I citometri di imaging di nuova progettazione sono all’avanguardia, ad alta produttività e a base di microlamiche, consentendo l’imaging delle cellule vive, il conteggio delle celle e l’analisi della fluorescenza multicanale di tutte le celle in ogni pozzo di un vaso di coltura in pochi minuti. Questo sistema consente una rapida quantificazione dei cambiamenti dinamici nella proliferazione e nella vitalità di un’intera popolazione cellulare con solo una minima interruzione della cultura. Ad esempio, siamo in grado di eseguire misure oggettive di confluenza nei giorni successivi in vitro per determinare la cinetica di crescita di ogni cultura derivata da diversi donatori. Molti protocolli in letteratura, in particolare quelli che comportano la differenziazione dei MPC, richiedono alle cellule di raggiungere un livello definito di confluenza prima di iniziare la differenziazione o il trattamento⁷. Il nostro metodo consente una determinazione oggettiva della confluenza di ogni pozzo in un vaso di coltura che consente ai ricercatori di iniziare il trattamento in modo imparziale e non soggettivo.

In passato, una delle principali limitazioni dell’uso di HMPC primarie era la bassa resa che limitava il numero di cellule disponibili per gli esperimenti. Noi e altri abbiamo mostrato che la resa di MPC dal tessuto della biopsia muscolare scheletrica è di 1/15 MPC per milligrammo di tessuto (Figura 1)⁸. Poiché il nostro protocollo consente quattro passaggi delle cellule prima della purificazione con la fluorescenza activated cell sorting (FACS), le nostre rese hMPC crioconservate, derivate da piccole quantità di tessuto biopsia (50-100 mg), sono sufficienti per affrontare gli obiettivi di ricerca dove sono necessari più esperimenti. Il nostro protocollo FACS produce una popolazione MPC pura (Pax7 positiva) di 80 dollari, quindi il nostro protocollo è ottimizzato sia per la resa che per la purezza.

Protocol

Questo protocollo è stato approvato dall’Institutional Review Board della Cornell University. Tutti i partecipanti sono stati esaminati per le condizioni di salute sottostanti e hanno dato il consenso informato. 1. Ottenere tessuto muscolare umano tramite la biopsia muscolare scheletrica Identificare il muscolo laterale vasto tramite palpazione, punti di riferimento anatomici e contrazione attiva del muscolo. Palpate il vasto lateralis facendo stringere al partecipante il …

Representative Results

I risultati rappresentativi della citometria di flusso dell’isolamento da hMPC dal tessuto muscolare umano possono essere visualizzati nella Figura 1. Gli hMPC possono essere identificati mediante i primi eventi basati sulla dispersione laterale e sulla dispersione in avanti per eliminare le cellule morte o i detriti, seguiti dalla selezione solo delle cellule che sono negative per 7-AAD e quindi sono vitali. La selezione delle celle positive per entrambi i m…

Discussion

Gli HMCC primari sono un importante modello di ricerca utilizzato per comprendere la biologia muscolare scheletrica e il processo rigenerativo. Inoltre, gli HMPC hanno il potenziale per essere utilizzati per la terapia. Tuttavia, ci sono sfide riconosciute nell’utilizzo di hMPC primari e terapeutici, compresa la comprensione limitata delle cellule derivate dagli esseri umani¹⁰. C’è anche un grande grado di variazione nella capacità di espansione tra le colture dei donatori, che limita il potenzi…

Materials

0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-Cl	Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate	VWR	664160	Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube	Falcon	352196	15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate	Grenier Bio-One	662 160	Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution	eBioscience	00-6993-50	Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16	BioLegend	303016	Conjugated antibody for FACS
Black 96-well cell culture plate	Grenier Bio-One	655079	96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S	Nexcelcom Bioscience		Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer	VWR	352350	Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail)	Corning	354236	Collagen for coating cell culture plates
Collagenase D	Roche	11 088 882 001	Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide	VWR	WN182	Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II	Sigma Life Sciences	D4693	A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder	Gibco	31600-034	Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	21600-010	PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate	J.T. Baker	4040-01	Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum	VWR	89510-186	Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12	Gibco	21700-026	Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum	Gibco	26-050-070	Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer	iNCyto	DHC-N0105	Used to count cells
Hibernate A	Gibco	A1247501	Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Life Technologies	H21492	DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P-4	Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer	Orflo	MXA006	Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes	Orflo	MXC002	Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter	Orflo		Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50062Z	Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159	BD Pharmingen	557747	Conjugated antibody for FACS
Penicillin/Streptomycin 100X Solution	Corning	30-002-CI	Antibiotics added to culture media
Propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566	DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor	Promega	G5071	Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Gibco	12648-010	Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3	Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes	VWR	60818-565	Tubes used for FACS
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42	Compensation beads fort calibrating flow FACS settings