Isolamento, cultura, caracterização e diferenciação de células progenitoras do músculo humano do procedimento de biópsia do músculo esquelético

Summary

Nós apresentamos técnicas para isolar-se, cultivando, caracterizando, e diferenciando pilhas preliminares humanas do progenitor do músculo (hMPCs) obtidas do tecido esqueletal da biópsia do músculo. os hmpcs obtidos e caracterizados através destes métodos podem ser usados para abordar subseqüentemente as perguntas da pesquisa relativas à miogenesis humana e à regeneração do músculo esqueletal.

Abstract

O uso do tecido humano primário e das células é ideal para a investigação de processos biológicos e fisiológicos, como o processo regenerativo do músculo esquelético. Há desafios reconhecidos para trabalhar com células-tronco adultas primárias humanas, particularmente células progenitoras musculares humanas (hMPCs) derivadas de biópsias de músculo esquelético, incluindo a baixa produção de células de tecido coletado e um grande grau de heterogeneidade de doadores de parâmetros de crescimento e morte entre culturas. Ao incorporar a heterogeneidade no projeto experimental exige um tamanho de amostra maior para detectar efeitos significativos, igualmente permite que nós identifiquem os mecanismos que fundamentam a variabilidade na capacidade da expansão de hmpc, e permitem assim que nós compreendam melhor heterogeneidade na regeneração muscular esquelética. Novos mecanismos que distinguem a capacidade de expansão das culturas têm o potencial de levar ao desenvolvimento de terapias para melhorar a regeneração muscular esquelética.

Introduction

O músculo esquelético é o maior sistema de órgãos do corpo humano, representando 30 − 40% da massa corporal inteira¹. Além do que seu papel bem reconhecido na locomoção, o músculo esqueletal mantem a temperatura e a postura de corpo, e joga um papel central na homeostase nutriente do corpo inteiro. Pesquisas envolvendo participantes humanos, animais e modelos de cultura celular são valiosas para abordar questões relacionadas à biologia e regeneração do músculo esquelético. A isolação e a cultura de pilhas preliminares humanas do progenitor do músculo (hMPCs) fornecem um modelo robusto que permita que as técnicas e as manipulações da cultura de pilha sejam aplicadas às amostras humanas. Uma vantagem de usar hmpcs é que eles mantêm o fenótipo genético e metabólico de cada doador^2,3. A manutenção do phenotype do doador permite que os investigadores examinem a variação inter-individual no processo myogenic. Por exemplo, empregamos nosso método de caracterização do hMPC para identificar diferenças relacionadas à idade e ao sexo na capacidade de expansão da população de hMPC⁴.

A finalidade deste protocolo é detalhar técnicas para isolar, cultura, caracterizar, e diferenciar hMPCs do tecido da biópsia do músculo esqueletal. Com base no trabalho anterior que descreveu hmpcs e identificou potenciais fabricantes de superfície celular para o isolamento de hmpc^5,6, este protocolo preenche uma lacuna crítica no^{conhecimento, ligando}o isolamento à caracterização de hmpcs. Além disso, as instruções detalhadas passo a passo incluídas neste protocolo tornam o isolamento e a caracterização do hMPC acessíveis a um amplo público científico, incluindo aqueles com experiência prévia limitada com hMPCs. Nosso protocolo está entre os primeiros a descrever o uso de um citômetro da imagem latente para seguir populações da pilha. Os citômetros recentemente projetados da imagem latente são State-of-the-art, elevado-throughput, e microplate-baseado, permitindo a imagem latente viva da pilha, a contagem da pilha, e a análise multicanais da fluorescência de todas as pilhas em cada poço de uma embarcação da cultura dentro dos minutos. Este sistema permite a quantificação rápida de mudanças dinâmicas na proliferação e na viabilidade de uma população inteira da pilha com somente o rompimento mínimo à cultura. Por exemplo, somos capazes de realizar medidas objetivas de confluência em dias sucessivos in vitro para determinar a cinética de crescimento de cada cultura derivada de diferentes doadores. Muitos protocolos na literatura, particularmente aqueles que envolvem a diferenciação de MPCs, necessitam de células para atingir um nível definido de confluência antes de iniciar a diferenciação ou tratamento⁷. Nosso método permite a determinação objetiva da confluência de cada poço em um vaso de cultura, permitindo que os pesquisadores iniciem o tratamento de forma imparcial e não-subjetiva.

No passado, uma limitação principal de usar hMPCs preliminares era baixos rendimentos que limitam o número de pilhas disponíveis para experiências. Nós e outros mostraram que o rendimento de MPCs do tecido de biópsia do músculo esquelético é de 1 − 15 MPCs por miligrama de tecido (Figura 1)⁸. Como nosso protocolo permite quatro passagens das células antes da purificação com a triagem de células ativadas por fluorescência (FACS), nossos rendimentos criopreservados de hMPC, derivados de pequenas quantidades de tecido de biópsia (50 − 100 mg), são suficientes para abordar os objetivos de pesquisa onde são necessários vários experimentos. Nosso protocolo FACS produz um ~ 80% puro (Pax7 positivo) MPC população, assim, nosso protocolo é otimizado tanto para o rendimento e pureza.

Protocol

Este protocolo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Cornell. Todos os participantes foram rastreados por condições de saúde subjacentes e deram consentimento informado. 1. obtendo o tecido muscular humano através da biópsia do músculo esquelético Identifique o músculo vasto vasto lateral via palpação, marcos anatômicos e contração ativa do músculo. Palpar o vasto vasto lateral por ter o participante apertar o músculo quadrí…

Representative Results

Os resultados da citometria de fluxo representativo do isolamento do hMPC do tecido muscular humano podem ser visualizados na Figura 1. hMPCs pode ser identificado pela primeira gating eventos baseados em dispersão lateral e dispersão para a frente para eliminar células mortas ou detritos, seguido por selecionar apenas as células que são negativas para 7-AAD e, portanto, são viáveis. A seleção de células positivas para ambos os marcadores de superf?…

Discussion

Os hMPCs primários são um importante modelo de pesquisa usado para compreender a biologia do músculo esquelético e o processo regenerativo. Adicionalmente, os hMPCs têm o potencial ser usado para a terapia. Entretanto, há uns desafios reconhecidos em usar hMPCs preliminares para a pesquisa e a terapia, incluindo a compreensão limitada das pilhas derivadas dos seres humanos¹⁰. Há também um grande grau de variação na capacidade de expansão entre as culturas doadoras, o que limita o poten…

Materials

0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-Cl	Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate	VWR	664160	Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube	Falcon	352196	15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate	Grenier Bio-One	662 160	Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution	eBioscience	00-6993-50	Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16	BioLegend	303016	Conjugated antibody for FACS
Black 96-well cell culture plate	Grenier Bio-One	655079	96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S	Nexcelcom Bioscience		Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer	VWR	352350	Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail)	Corning	354236	Collagen for coating cell culture plates
Collagenase D	Roche	11 088 882 001	Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide	VWR	WN182	Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II	Sigma Life Sciences	D4693	A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder	Gibco	31600-034	Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	21600-010	PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate	J.T. Baker	4040-01	Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum	VWR	89510-186	Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12	Gibco	21700-026	Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum	Gibco	26-050-070	Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer	iNCyto	DHC-N0105	Used to count cells
Hibernate A	Gibco	A1247501	Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Life Technologies	H21492	DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P-4	Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer	Orflo	MXA006	Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes	Orflo	MXC002	Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter	Orflo		Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50062Z	Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159	BD Pharmingen	557747	Conjugated antibody for FACS
Penicillin/Streptomycin 100X Solution	Corning	30-002-CI	Antibiotics added to culture media
Propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566	DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor	Promega	G5071	Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Gibco	12648-010	Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3	Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes	VWR	60818-565	Tubes used for FACS
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42	Compensation beads fort calibrating flow FACS settings